Изучение ориентации белков в мембранах

Важнейшую роль в жизнедеятельности всех клеток всех организмов играют трансмембран­ные белки. Большой интерес к исследованию этой обширной группы соединений определяется не только участием этих белков в ключевых реакциях — транспорт низкомолекулярных соеди­нений, энергообеспечение клеток и многие другие, но и расширением возможностей для их экс­периментального исследования.

Аквапорины — белки, интегрированные в клеточные мембраны клеток различных тканей и растений, и животных. Основная функция этих белков способствовать проникновению молекул воды через плазматические мембраны. Применение дейтериевой метки при изучении высоко- очищенного белка AQP1 позволило значительно продвинуться в изучении структуры данного аквапорина. Так, было установлено, что AQP1 имеет высокую степень спирализации — участки а- спирали составляют порядка 42-48 % его протяженности и при этом плотно упакованы, тогда как р-участков почти нет. Низкий уровень изотопного обмена Н -» D показывает, что, как и у многих трансмембранных белков, а-спирали находятся в основном в толще мембраны (в данном случае они проходят сквозь мембраны под углом 21-27° к нормали).

Антибиотические свойства некоторых пептидов определяются их способностью встраиваться в липидный слой клеточных мембран. Соответственно, изучение такого рода взаимодействий пред­ставляется крайне важным как с теоретической, так и с практической точек зрения. Возможность широкого применения изотопных методов в таких исследованиях облегчает получение новой информации. Так, использование поляризационной модулируемой инфракрасной отраженной абсорбционной спектроскопии (PM-IRRAS) позволило установить поведение молекул двух типов грамицидинов на поверхности липидного бислоя.

Для более детального исследования структуры, а также механизмов встраивания грами­цидина М в липидный бислой, применили метод твердофазного ЯМР ¹⁵ї\Г-меченньіх образцов в условиях обмена Н -» D. Комбинированное изучение ориентации пептида и наблюдения за межатомными расстояниями нескольких отдельных его сайтов позволило заключить, что мо­лекулы грамицидина М представляют собой антипараллельный димер, и что он встраивается в мембрану в интактном виде, т. е. без развала на мономеры. Получено также строгое доказа­тельство того, что встраивание белка не приводит к резкому падению электрического сопроти­вления мембран. Этот факт указывает на существенное различие природы антибиотического действия грамицидина М и трансмембранных пептидных антибиотиков образующих ионные каналы.

Бактериальные движители — жгутики — также следует рассматривать как сложный транс мембранный белковый комплекс с четко определенной функцией. Жгутики, как известно, получа ют энергию для работы от мембранного градиента — либо протонов, либо ионов натрия, однако мо лекулярный механизм вращения жгутиков до сих пор не вполне понятен. Описаны мутанты Е. cot (motA и motB), имеющие повреждения в мембранных белках, ассоциирующихся со статором это: клеточной модели «мотора». Ранее было показано, что данные мутации приводят к замене крайн< важных для функционирования белков аминокислотных остатков: Рго₁₇₃ у мутантов motA и Asp₃₂ — у motB. Использование изотопного эффекта замены Н₂О -* D₂O, а также сравнение пове дения бактерий с различными сочетаниями мутационных повреждений позволили заключить, чт< аминокислотный остаток Рго₁₇₃ имеет ключевое значение в связывании потока протонов «мотора» и что эта аминокислота пространственно расположена в канале вблизи Asp₃₂.

3.5.