«Пурпурные мембраны» и фоточувствительные белки в D2O

«Пурпурные мембраны» (ПМ) архебактерий — сложно организованный молекулярный комп леке, включающий различные липиды и ретинальсодержащий фоточувствительный белок — бак териородопсин (БР).

Применение метода резонансной Раман-спектроскопии при исследовании нативных и высоко дейтерированных пурпурных мембран в D₂O позволило подтвердить высказанное ранее предполо жение о том, что Шиффово основание БР депротонируется быстрее, чем продолжительность фазь М₄₁₂. Более того, исследуя кинетику в D₂O при К = 488,0 нм автор более подробно охарактеризовав поведение непротонированного интермедиата, предшествующего этой фазе фотоцикла. Кинетиче ские спектры высокодейтерированных пурпурных мембран в нормальной воде подтвердили пред положение, что существенные изменения в протяженности существования разных интермедиатої происходят при замене необмениваемых протонов мембран на дейтероны. Кинетические Раман спектры полностью дейтерированных пурпурных мембран в Н₂О позволили сделать еще одиь очень важный вывод: наблюдаются существенные изменения в соотношениях протяженности ста дий фотоцикла в том случае, когда необмениваемые протоны пурпурных мембран заменены дейте рием.

Квазиупругое некогерентное рассеяние на водородных атомах, которые распределены в биомо лекулах достаточно равномерно, позволяет исследовать диффузионные движения, происходящие за пико- или наносекунды. Исследование проводили на препаратах пурпурных мембран, помещен ных в условия разной увлажненности тяжелой водой. Различия в спектрах рассеяния трактовали как следствие различий именно в уровне гидратации БР. Поскольку снижение гидратации приво дит к снижению внутримолекулярной пластичности белка, применение данного подхода позволи ло классифицировать несколько типов диффузионных движений, происходящих в пурпурных мембранах в различных физиологических состояниях.

Использовали температурный сдвиг для определения конформационных изменений, происхо дящих в молекулах БР. Оказалось, что при резком повышении на 15 °С температуры тяжелой во

ды, окружающей белок (до предкритического уровня — 72 °С), наблюдались изменения_ -спира

лей, состоящие в увеличении открытости гидрофобных участков белковой цепи для молекул водь среды.

При изучении фотоцикла БР, выделенного из клеток мутанта E₂₀₄Q установили, что вторая половина цикла замедлена примерно в 10 раз по сравнению с контрольными измерениями. Пред полагалось, что данная мутация приводит к инактивации протон-донорной группы. Изучент реакций такого «ослабленного» цикла в условиях различных значений pH среды и на фоне D₂O по казало, что высвобождение протона происходит конкурентно с N ** О переходом и с терминальной реизомеризацией молекулы ретиналя. Соответственно, в таком варианте фотоцикла лимитирую щим фактором становится вовлечение протона из окружающей среды. Слабое закисление средь: кислыми анионами азида, цианатом или формиатом ускоряет прохождение фазы О-интермедиат; до полного восстановления общего времени фотоцикла, характерного для компонентов диког< типа. Продолжение изучения механизма переноса протона в БР проводили оценивая изотопный эффект при замене растворителя Н₂О на D₂O. Результаты показали, что механизм быстрой внутри

молекулярной передачи протона подобен ранее предложенной модели для льда, где лимитирую­щим фактором является подвижность протона в пределах Н-связи.

Изучали фотоиндуцированные изменения объема молекул БР в Н₂О и в D₂O, а также ки­нетику и энергетику ранних этапов фотоцикла методами пульс-радиоакустики. Было зафик­сировано два типа изменения объема: быстрое увеличение (200 нс, 2,5 ± 0,ЗА ’/молекулу) и медленное сжатие (1 мкс, —3,7 ± 0,ЗА³/молекулу).

Действие тяжелой воды в отношении позднего интермедиата О приводит к снижению его обра­зования и превращения примерно в 5,5 раз по сравнению с нормальной водой. Поскольку уровень перехода О -» БР отражает уровень депротонирования первичного акцептора протона (Asp₈₅), при низких значениях pH он контролируется депротонированием Glui₉₄ и Glu_2(M — ключевых амино­кислот группы доноров протонов в молекле БР.

Как отмечалось выше, хорошо изученные модельные объекты служат прототипом для исследо­вания более новых объектов. Так произошло и с исследованиями фотоцикла фотофобного рецеп­тора N atronobacterium pharaonis, который изучали в различных внешних условиях. Варьировали освещенность, длину волны, температуру и pH среды, заменяли природную воду на тяжелую. Дан­ные определения кинетики фотоцикла рецептора позволили предложить модель, подобную моде­ли фотоцикла бактериородопсина: идентифицировали девять четко разделимых стадий, соответст­вующих различным состояниям белка, определяемых пятью спектрально четко различимыми состояниями хромофора. Поскольку фотоцикл N. pharaonis слабо реагирует на замену растворите­ля Н₂О -» D₂O и практически на зависит от pH среды, был сделан вывод, что фотоцикл фотофобно­го рецептора в большей степени зависит от динамики конформационных изменений белка, чем показано для БР.

3.6.