Анализ стационарного состояния.

Для кинетической характери стики транспортных систем, которые катализируют облегчённую диффу­зию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния.

В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые прово­дились на пермеазах, встроенных в мембранные везикулы. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой {цис —> транс), но также и возвращаться обратно {транс —>цис). Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

1. Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны

{цис). Начальная скорость транспорта измеряется для одно­направленного потока. Важно, что для обеспечения постоянно­го потока транспортируемого вещества переносчик (пермеаза) должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию [5] для процесса, протекающего в любом направлении (например, для переноса вещества внутрь везикул или для выведения его из везикул).

2. Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой кон­

центрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка - только с одной стороны {цис). В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Изме­ряют поток как функцию [S].

3. Меченый субстрат находится с цис-стороны мембраны, а в

насыщающей концентрации он присутствует на противополож­ной {транс) стороне. Измеряют поток как функцию [S]_4UC. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток {цис транс). Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

4.

ны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находит­ся на транс-стороне, а изменяется. В этом случае измеря­ют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пере­секает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют и_ш._1Х и К_м, которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их.

Как и в классических работах по энзимологии, очень полезным мо­жет оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополни­тельную информацию.

Контрольные вопросы и задания

1. Какие ионные каналы называются нерегулируемыми?

2. Сколько белковых субъединиц формируют калиевый канал?

3. Какие элементы вторичной структуры субъединиц ионных кана­лов формируют фильтр селективности?

4. Что обеспечивает селективность калиевого канала?

5. Опишите двухцентровую модель проводимости калиевого канала.

6. В чем суть пэтч-метода исследования ионных каналов?

7. Сравните четыре стандартных варианта пэтч-регистрации актив­ности ионных каналов.

8. Как изменяется трансмембранный профиль свободной энергии при открытии ионного канала?

*1 к₂

9. Каким образом схема Е+ S_in~^ES^E+ S_out описывает работу

к-1

ионного канала?

10. Запишите уравнение Михаэлиса и поясните входящие в него параметры.

11. Чем определяется селективность ионного канала в модели Михаэлиса-Ментен в случае [S]