Протокол

1. Небольшой кусок коралла поместите в 300 мкл раствора “TRI reagent” (образец ткани не должен превышать 10% объема реагента), гомогенизируйте с помощью гомогенизатора Даунса в пробирке и оставьте на 5-20 мин на столе.

Внимание! Для того чтобы избежать деградации РНК, ткань следует гомогенизировать как можно быстрее и тщательнее.

2. Нерастворившийся клеточный дебрис осадите центрифугированием в течение 5 - 10 мин при максимальной скорости на настольной центрифуге при температуре +4°С. Аккуратно отберите надосадочную жидкость и перенесите ее в новую пробирку.

3. К полученному раствору добавьте 60 мкл хлороформа (из расчета 200 мкл на 1 мл TRI reagent). Перемешайте встряхиванием (на вортексе).

4. Центрифугируйте 10-15 мин при максимальной скорости на настольной центрифуге при температуре +4°С.

5. Осторожно отберите водную фазу (сверху), стараясь не задеть интерфазу (лучше потерять часть объема, чем захватить лишнее) и перенесите в новую пробирку.

Внимание! В процессе центрифугирования формируется три фазы: нижняя содержит фенол и хлороформ, интерфаза

содержит денатурированный белок и верхняя водная фаза - РНК. Если интерфаза большая, рекомендуется повторить процедуры 3­5.

6. Добавьте к образцу 150 мкл изопропанола. Хорошо перемешайте встряхиванием на вортексе и инкубируйте на столе 10-15 мин.

7. Центрифугируйте образцы в течение 10 мин при максимальной скорости на комнатной температуре.

8. Осторожно и полностью отберите супернатант, сохраняя осадок.

Внимание! Преципитат не обязательно сформирует аккуратный осадок, а может быть распределен по задней стенке пробирки и почти невидим. Позиционируйте пробирки в центрифуге таким образом, чтобы знать, на какой стенке должен формироваться осадок.

9. Добавьте к осадку 0,5 мл 80% этанола.

10. Центрифугируйте пробирку 10 мин при максимальной скорости на настольной центрифуге при комнатной температуре.

11. Оставьте пробирки с осадком в вертикальном положении на столе на столе 5-15 мин до полного высыхания.

12. Растворите осадок в 20-50 мкл стерильной воды. При растворении образец рекомендуется прогреть 65°С 2-3 мин.

13. Проверьте качество выделения РНК методом гель-электрофореза:

13.1 . Приготовьте 1,2% агарозный гель на 1х ТАЕ-буфере с добавлением бромистого этидия (0,3 мг/л).

Внимание! Бромистый этидий рекомендуется добавить в расплавленную агарозу перед заливкой геля. Это позволяет избежать дополнительной процедуры прокрашивания геля (в процессе которой РНК может существенно деградировать).

Внимание! Для приготовления и разведения ТАЕ буфера можно использовать обычную дистиллированную воду.

13.2.Заполните электрофорезную камеру свежим 1х ТАЕ- буфером с добавлением бромистого этидия (0,3 мг/л).

Внимание! Для анализа РНК используйте только чистые электрофорезные камеры, свежий гель и буфер, так как примеси РНКаз могут привести к деградации РНК во время электрофореза.

13.3.Отберите 0,5 и 2 мкл аликвоты раствора РНК и смешайте с 2-3 объемами буфера для нанесения образцов. В соседнюю лунку добавьте маркер длин ДНК (1 kb DNA ladder) в количестве 50 нг на дорожку. Оставшуюся РНК храните на -20°С.

13.4.Проведите разделение образцов в геле, используя рабочее напряжение не более 10 В/см (10 В на каждый см длины между электродами).

13.5. Сравните результат электрофореза с типичным результатом, приведенным на рис. 3.1. При хорошем качестве выделенной РНК соотношение интенсивности полос 18S и 28S должно быть не менее 1:1.

Внимание! Первым признаком деградации РНК на неденатурирующем гель-электрофорезе в агарозе служит появление слабого шмера от полос рРНК в сторону фронта и изменение соотношения интенсивности полос 28S/18S рРНК в пользу 18S. РНК с такой степенью деградации может быть использована для синтеза кДНК для большинства приложений. Однако, если шмер от низкомолекулярной фракции РНК столь интенсивен, что полоса рРНК не имеет выраженной нижней границы, то такая РНК не пригодна для синтеза кДНК.

Рис. 3.1 . Визуализация суммарной РНК, выделенной из кораллового полипа Clavularia: дорожка 1 - деградировавшая РНК, дорожки 2, 3 - РНК приемлемого качества; М - маркер длин ДНК

(1 kb DNA ladder, Сибэнзим)

3.3.