Введение

Актуальность проблемы

В конце ХХ века злокачественные опухоли женской репродуктивной системы во всем мире стали одним из главных факторов отрицательных демографических тенденций.

Пятилетняя выживаемость больных варьирует в зависимости от стадии заболевания: около 70% при I стадии, 45% при II стадии, 17% при III стадии, около 5% при IV стадии. При этом практически у 70-80% больных рак яичников впервые диагностируются в III-IV стадиях. В среднем пятилетняя выживаемость больных составляет 35-40% [Petricoin et al, 2002, Jacobs et al, 2004, Аксель Е.М.,2012].

Основными причинами столь неутешительных статистических тенденций является бессимптомное течение рака яичников на ранних стадиях и, как следствие, крайне низкий уровень его ранней диагностики, малоэффективное лечение, особенно при рецидивах заболевания [Жорданиа К.И., 2005, Винокуров В.И., 2004] .

Стратегия повышения эффективности ранней диагностики рака яичников предполагает проведение скрининга женского населения - массового и селективного (обследование групп риска). Для осуществления таких мероприятий требуются простые, надежные и дешевые скрининговые методы, которые, к сожалению, пока отсутствуют [Акуленко Л.В., 2005,

Жорданиа К.И., 2005, Имянитов Е.Н., 2008, Kurman RT,2010].

Большие надежды в 90-х годах прошлого века возлагались на маркер рака яичников СА125. Однако, как оказалось, чувствительность этого биомаркера составляет не более 65%.

Интенсивное развитие протеомных технологий в начале ХXI века открыло новые перспективы для поиска биомаркеров заболеваний. Одной из наиболее перспективных технологий, используемых в этих целях, является масс-спектрометрия белковых чипов SELDI-TOF-MS (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry - усиленная поверхностью времяпролетная лазерная десорбция/ионизация масс-спектрометрия) -

экспрессный и высокоселективный метод для анализа белков и пептидов, который обладает высокой воспроизводимостью результатов и имеет фемтомолярный диапазон измерений. В настоящее время масс-спектрометрия находит все более широкое применение в медицине. Благодаря этому методу возникло новое направление - клиническая протеомика, которая занимается инвентаризацией белков человека, кодируемых его генами, дополняя, таким образом, геномные исследования. Именно состав белков определяет функциональное назначение каждой клетки, в том числе и опухолевой, а также отражает реализацию возможностей проявления имеющихся наследственных или приобретенных генетических дефектов. Изменение концентрации отдельных белков указывает на появление патологии и может быть использовано в диагностических целях. В настоящее время основной идеологией поиска новых малоинвазивных способов диагностики онкологических заболеваний, в том числе и рака яичников, является разработка диагностических систем на основе протеомного профилирования сыворотки крови для идентификации опухолевых маркеров [Toropygin I., Serebryakova M.V. et al, 2007].

Особый интерес вызывает сывороточный амилоид А острой фазы (A- SAA). Несмотря на то, что этот белок давно известен как маркер воспаления, он обладает рядом уникальных свойств. Во-первых, его концентрация в сыворотке крови в норме в 10-100 раз ниже, чем концентрация других опухолевых маркеров.

Вышеизложенные научные факты побудили нас предпринять клиникоэкспериментальное исследование, направленное на поиск новых маркеров рака яичников с использованием, как традиционных (ИФА), так и новейших протеомных (масс-спектрометрия SELDI-TOF) технологий.

Следует отметить, что проведение настоящего исследования было поддержано Государственным контрактом от 28 февраля 2006 года №02.442.11.7426 в рамках Федеральной целевой научно-технической программы: «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» - «Белок сывороточный амилоид А как потенциальный маркер для ранней протеомной диагностики рака яичника».

Цель исследования

Изучить возможности повышения эффективности дифференциальной диагностики опухолей гениталий и своевременной диагностики рака яичников на основе использования комбинации сывороточных белков A-SAA и СА125.

Задачи исследования

1. Проанализировать и сформировать исследуемую выборку пациенток, отвечающую требованиям разработки адекватного диагностического метода и банк образцов их сывороток крови.

2. Методом иммуноферментного анализа определить концентрации СА125 и А-SAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки.

3. Провести масс-спектрометрическое профилирование (SELDI-TOF) сывороток крови пациенток исследуемой выборки в условиях, оптимизированных для измерения уровня А-SAA.

4. Определить чувствительность масс-спектрометрической детекции А- SAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки.

5. На основе многофакторного анализа оценить возможность использования в качестве сывороточного маркера рака яичников А-SAA, определяемого методом масс-спектрометрии отдельно и в комбинации со значениями концентраций А-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна исследования

Показана применимость масс-спектрометрического метода для

распознавания сывороток крови больных раком яичников,

доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин.

Определена чувствительность масс-спектрометрии SELDI-TOF для определения белка А-SAA в составе сыворотки крови.

На основе многофакторного анализа комбинации данных масс- спектрометрической детекции А-SAA и значений концентраций А-SAA и СА125, измеренных методом иммуноферментного анализа, впервые разработана экспериментальная система диагностики рака яичника, точность которой составляет 95,2%.

Научно-практическая значимость исследования

Разработанная экспериментальная система протеомной диагностики опухолей яичника является научно обоснованной предпосылкой для создания и внедрения в практику аппаратно-программного комплекса, который целесообразно использовать для скрининга и ранней диагностики рака яичников. Рассчитанные пороговые значения диагностически значимых маркеров способствуют повышению точности дифференциальной диагностики овариальных образований.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Точность распознавания сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин методом масс-спектрометрии SELDI-TOF составляет 89,5%.

2. Сывороточный А-SAA, определяемый методом масс-спектрометрии SELDI-TOF, является маркером рака яичника при критическом значении его концентрации 0,3 г/л (2,6x10-5 М), обладая чувствительностью 50% и специфичностью 96,4%.

3. Добавление к данным масс-спектрометрической детекции A-SAA данных о концентрациях A-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа, повышает точность диагностики рака яичников до 95,2%.

Внедрение результатов исследования в практику

1. Материалы диссертации доложены на 4-м Ежегодном Всемирном Конгрессе международной организации «Протеом человека» (HUPO 4-th Annual World Congress), Мюнхен, Германия, 28 августа-1 сентября 2005 года;

Результаты исследвания используются на семинарских занятиях для студентов, ординаторов и аспирантов на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Пирогова Н.И.

Личное участие автора в разработке проблемы

Автором самостоятельно сформирована исследуемая выборка пациенток и банк образцов сывороток крови.

Автор принимала участие в проведении статистической обработки материала исследования, обсуждении результатов, подготовке и оформлении публикаций. Оформление диссертации и автореферата выполнены автором самостоятельно.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения , обзора литературы, описания материалов и методов, описания

результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов,

практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Иллюстративный материал включает 11 таблиц, 9 рисунков и диаграмм. Список использованной литературы содержит 119 источников; из них 15 отечественных и 104 зарубежных.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО ПНИУ им. Пирогова Н.И. № от октября 2014г.