Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Каждая шестая супружеская пара на земле сталкивалась с проблемой нарушения репродуктивной функции [72]. На сегодняшний момент (2013 г.) более пяти миллионов человек были рождены при помощи вспомогательных репродуктивных технологий, однако эффективность ЭКО/ИКСИ в последнее десятилетие остается на среднем уровне, не превышая 35,5%-32,2% даже в ведущих клиниках мира [72].

Формирование функционально активного (рецептивного) эндометрия обеспечивается множеством факторов: анатомической целостностью матки, оптимальным гормональным фоном, удовлетворительными

гемодинамическими параметрами сосудистой сети матки, отсутствием хронического воспаления и другими составляющими [19, 34, 39, 40, 42]. При этом отсутствие внутриматочной патологии не всегда является свидетельством нормальной функции эндометрия. Согласно публикациям последних лет, особое клиническое значение имеют такие вненозологические структурно-функциональные изменения в эндометрии, нарушающие его рецептивность, как снижение толщины эндометрия [5, 59, 179, 202, 203], несоответствие структуры эндометрия фазе менструального цикла [19, 25, 33], нарушение внутриматочной перфузии со снижением эндометриального и субэндометриального уровня кровотока [5, 151, 153, 154]. Все

патологические процессы в эндометрии, в том числе проявляющиеся и вненозологичными формами, приводят к нарушению функции эндометрия и, следовательно, препятствуют успешному наступлению и развитию беременности.

Надо полагать, что столь разнообразные системные и местные нарушения могут оказывать влияние на рецептивность эндометрия через различные патогенетические механизмы, что затрудняет оценку качества эндометрия методами функциональной диагностики.

Целью настоящего исследования являлось повышение качества диагностики причин нарушения имплантации у пациенток с бесплодием неясного генеза.

Нами был проведен анализ особенностей эхографических характеристик эндометрия и внутриматочной перфузии у пациенток с бесплодием неясного генеза и трубно-перитонеальным бесплодием, а также анализ влияния полиморфизма генов, предрасполагающих к нарушению ангиогенеза и развитию тромбофилии, на внутриматочную гемодинамику и формирование предрасположенности к нарушению имплантации.

Всего в работе было обследовано 176 женщины в возрасте от 27 до 37 лет, из них 136 пациенток с бесплодием (I группа - 76 пациенток с трубноперитонеальным бесплодием и II группа - 60 женщин с бесплодием неясного генеза) и 40 фертильных женщин с реализованной репродуктивной функцией, то есть имевших в анамнезе как минимум одни срочные роды здоровыми детьми.

При анализе клинико-анамнестических данных обследуемых пациенток были выявлены некоторые различия. Возраст обследованных женщин варьировал от 22 до 37 лет, составил 31,8±3,23 года и достоверно между группами не различался.

При сборе семейного анамнеза обращало на себя внимание наличие у близких родственников пациенток с бесплодием неясного генеза достаточно высокой частоты заболеваний сердечно-сосудистой системы (31,7%). Кроме того, у пациенток с бесплодием неясного генеза достоверно чаще (по сравнению с женщинами других групп) отмечались самопроизвольные прерывания беременности в анамнезе. По-видимому, данные особенности семейного и гинекологического анамнеза связаны с высокой распространенностью наследственных полиморфизмов генов развития тромбофилии в этой группе (35%). Известно, что полиморфизмы генов гемостаза приводят к нарушению свертывающей системы крови и увеличивают риск развития ряда заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца, венозных тромбозов, артериальных тромбоэмоболий, инсультов , что особенно важно, у пациенток с нарушением репродуктивной функции и осложнениями беременности. Так в C. Butt и соавт. выявили более чем пятикратное увеличение риска инфаркта миокарда у пациентов моложе 51 года с генотипом 20210A протромбина [84]. Масштабное многоцентровое исследование полиморфизма Лейдена более чем с 300 наблюдениями установило повышенный 3,7-кратный риск венозной тромбоэмболии при наличии мутантного аллеля в генотипе [75, 150]. При исследовании связи между полиморфизмом C677T гена MTHFR и сердечно-сосудистыми заболеваниями обнаружено, что гомозиготное сочетание аллелей Т/Т встречается гораздо чаще у пациентов с кардиоваскулярными заболеваниями, чем у здоровых [127].

Диагноз аденомиоза и миомы матки с субсерозным или интерстициальным расположением узлов диаметром до 3 см был поставлен не более 10% пациенток в каждой группе. Мы посчитали целесообразным исключить пациенток с диффузной формой аденомиоза, субмукозной локализацией миомы или с наличием крупных (более 2,5 см) миоматозных узлов, так как, по данным литературы, объемные образования матки могут служить самостоятельной причиной нарушения репродуктивной функции и оказывать влияние на внутриматочную перфузию [15, 17, 41, 42].

Эндокринные заболевания не встречались в нашем исследовании, так как отклонения уровня гормонов от нормы также явились критерием исключения пациенток из групп наблюдения в связи с их влиянием на гемодинамику. Например, для ановуляторных циклов характерен

монотонный высокий уровень ИР и ПИ в маточных артериях, может отсутствовать конечный диастолический кровоток, базальные артерии не визуализируются у 38% обследованных, а визуализация спиральных артерий невозможна практически у всех пациенток [56].

При изучении гинекологического анамнеза обращали на себя внимание особенности инфекционного анамнеза у пациенток с бесплодием. У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием чаще отмечалось воспаление нижних отделов полового тракта в анамнезе, 20,4% пациенток перенесли хламидиоз; спаечный процесс в малом тазу был диагностирован у половины женщин этой группы, что, безусловно, объясняется особенностью отбора наблюдаемых в эту группу. Известно, что у большинства женщин причиной окклюзии маточных труб является воспалительный процесс, инициируемый генитальной инфекцией, среди которой высока частота хламидийной, мико- и уреаплазменной [32, 57].

Среди обследованных пациенток наибольшая частота внутриматочных вмешательств отмечена в группе с трубно-перитонеальным бесплодием.

Актуальным вопросом репродуктологии является поиск «идеального» маркера имплантационного потенциала эндометрия. Большое значение принадлежит гистероскопии и гистологическому исследованию эндометрия, однако метод является инвазивным и поэтому сопряжен с рядом возможных осложнений. Что касается молекулярных и биохимических маркеров нарушений рецептивности эндометрия, то до сегодняшнего дня опубликованные данные остаются противоречивыми и дискутабельными [60, 61, 87, 98, 187].

С этой же целью в последние десятилетия в репродуктологии широко используется метод трансвагинальной эхографии c ЦДК и спектральной допплерометрией сосудов матки. Данный метод имеет неоспоримые преимущества, так как является неинвазивным, обладает высокой чувствительностью и точностью [5, 63, 69, 88, 107, 109, 121, 132].

Эхографическое трансвагинальное исследование, включающее дуплексное сканирование и допплерометрию, проводилось нами в период так называемого «окна имплантации», то есть на 5-8 день после овуляции. При интерпретации эхографических характеристик эндометрия мы уделяли внимание структуре и толщине М-эхо, симметричности, его соответствию дню менструального цикла. Допплерометрическое исследование проводилось во всех сосудах бассейна маточных артерий: от наиболее крупных восходящих ветвей a. uteri - к a. radialis в толще миометрия и далее к терминальным ветвям - a. basalis и а^пд^, кровоснабжающим базальный слой и толщу эндометрия. Оценивались интенсивность кровообращения (т.е. количество цветовых сигналов) и характер распределения цветовых эхосигналов. Затем проводили допплерометрию c количественной оценкой уголнезависимых показателей кривых скоростей кровотока (КСК) сосудов матки: систоло-диастолического соотношения (СДО), пульсационного индекса (ПИ), индекса резистентности (ИР).

При исследовании толщины М-эхо, что является общепринятой процедурой в рамках обследования пациенток с бесплодием [34, 47, 135], нами установлено снижение толщины эндометрия по сравнению с фертильными пациентками. При этом достоверных различий в толщине М- эхо у пациенток с различным генезом бесплодия и фертильными женщинами нами выявлено не было (I группа - 8,87±1,34 мм; II группа - 8,95±1,23 мм; контрольная группа - 10,3±1,4 мм). Отсутствие достоверных различий в толщине М-эхо у бесплодных и фертильных пациенток отмечается и другими исследователями [106, 135, 166].

Согласно данным литературы, тонкий эндометрий (меньше 7-8 мм на 21 день менструального цикла) считается прогностически неблагоприятным в отношении шанса наступления беременности [179]. В то же время, ряд исследователей описывает наступление беременности при 6 мм и даже при 4 мм [177, 189, 200]. Некоторые авторы отрицают значение толщины М-эхо как параметра, отражающего его рецептивность [137, 166], но подчеркивают важность оценки уровня внутриматочной перфузии и структуры эндометрия как критериев его функциональной полноценности. В нашем исследовании у пациенток с бесплодием по сравнению с контрольной группой эхографическая картина трехслойного эндометрия определялась достоверно реже, хотя между группами бесплодия существенной разницы в частоте встречаемости не наблюдалось (30,3% и 23,3%).

В настоящий момент общепринятым является взгляд на процесс васкуляризации эндометрия как одного из основополагающих в развитии рецепторных свойств эндометрия. Успешная имплантация и развитие плодного яйца невозможны без активного кровоснабжения эндометрия и подлежащего миометрия в зоне имплантационной площадки [5, 46, 132, 133].

Анализируя все виды нарушений гемодинамики - выраженные, проявляющиеся в виде отсутствия визуализации артерий или определения сосудов лишь венозного типа, снижения уровня васкуляризации, а также повышения уголнезависимых коэффициентов при измерении КСК - мы обнаружили достоверные отличия практически на всех уровнях маточного древа среди фертильных женщин и пациенток с нарушениями репродуктивной функции.

В соответствии с последними тенденциями в области репродуктивных ультразвуковых исследований, большое значение при исследовании внутриматочной перфузии нами отдавалось изучению эндометриального и субэндометриального кровотоков.

Маточные и радиальные артерии визуализировались у пациенток всех трех групп, тогда как базальные и спиральные артерии регистрировались достоверно реже у пациенток с бесплодием по сравнению с фертильными женщинами, но и у 12,5% здоровых женщин спиральные артерии не определялись. Наши данные соответствуют результатам международных исследований, при которых возможность визуализации сосудов эндометрия составляет от 8,6% до 94,5% у бесплодных женщин [5, 200], что обусловлено разницей в технических возможностях ультразвуковых аппаратов и отсутствием единой методики исследования сосудистого древа матки.

Очевидно, что васкуляризация эндометрия в значительной степени зависит от состояния гемодинамики в главных маточных и радиальных артериях миометрия. В настоящем исследовании у бесплодных пациенток показатели сопротивляемости сосудов также были повышены на уровне крупных сосудов (I группа МА - 27,6%, РА - 9,3%; II группа МА - 45%, РА - 11,7%).

Наши данные о достоверных различиях в характеристиках внутриматочной перфузии у бесплодных и фертильных женщин находят подтверждения в ряде опубликованных работ. Так, S. Freidler и соавт. утверждали, что уровень внутриматочной перфузии не является единственным условием успешной имплантации и развития беременности, но характеризуется высокой прогностической значимостью по сравнению с другими ультразвуковыми параметрами, например, толщиной М-эхо [109].

Существующая дискуссия на предмет прогностической значимости исследования кровотока в сосудах матки у бесплодных женщин, на наш взгляд, связана с отсутствием единых методических подходов, нормативных показателей, технической оснащенности и недифференциального подхода в области оценки и интерпретации данных эхографических и допплерометрических показателей. Безусловно, на гемоперфузию не могут не оказывать влияния такие составляющие как коагуляционный потенциал крови, гормональный профиль, морфологические особенности эндометрия и др. В связи с чем, нами была оценена взаимосвязь эхографических характеристик эндометрия и допплерометрических показателей сосудистой сети матки у пациенток с различным генезом бесплодия.

Отличие нашего исследования от существующих работ, посвященных ультразвуковым параметрам оценки качества эндометрия, заключается в дифференцированном подходе к пациенткам с бесплодием, учитывающим неоднородность возможных патогенетических механизмов повреждения эндометрия, нарушающих его рост и васкуляризацию.

При сравнении толщины эндометрия и численных значений ПИ на уровне крупных сосудов (восходящих ветвей маточных и радиальных артерий) у пациенток с бесплодием различного генеза корреляции выявлено не было. Однако дальнейшее сканирование мелких, терминальных ветвей маточных артерий позволило выявить достоверную связь между толщиной эндометрия и характеристиками кровотока в спиральных и базальных артериях у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Так, при нормальной толщине эндометрия (>7 мм) уровень эндометриальной и субэндометриальной перфузии был в пределах нормы, при нарушенной внутриматочной гемодинамике на уровне терминальных ветвей сосудистого древа матки величина М-эхо была снижена.

В отличие от пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, у пациенток с бесплодием неясного генеза зависимости между толщиной эндометрия и показателями допплерометрии нами не выявлено. При одной и той же толщине эндометрия уровень внутриматочной перфузии на всем протяжении сосудистой сети матки был различным. Выявленная особенность позволяет заключить, что толщина М-эхо у таких пациенток не отражает уровень кровоснабжения ткани эндометрия, в связи с этим оценка функциональной активности эндометрия при эхографическом исследовании у пациенток с бесплодием неясного генеза не информативна. Такие показатели, в целом, корреспондируют с данными, полученными Д. М. Белоусовым при оценке эндометрия у женщин с невынашиванием беременности: автором была выделена группа женщин, у которых сниженная толщина М-эхо не сопровождалась нарушениями гемодинамики и не влияла на репродукцию в отсутствии хронического эндометрита [5].

Результаты нашего исследования продемонстрировали неоднородность этиопатогенетических механизмов повреждения структуры и функции эндометрия у пациенток с различным генезом бесплодия, что подтверждается исследованиями ряда авторов. У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием и неудачными попытками ЭКО с высокой частотой определяются признаки хронического эндометрита [18, 39, 57].

Исследованиями в области патофизиологии установлено, что хронический эндометрит - процесс патологической регенерации ткани с отложением интерстициальных коллагенов, неравномерным фиброзом стромы

эндометрия, вследствие чего нарушается процесс пролиферации

функционального слоя эндометрия, что сказывается на его толщине, а секреторная трансформация происходит неполноценно и асинхронно, что ведет к нарушению внутриэндометриального кровотока и нарушению рецептивности эндометрия с последующими имплантационными потерями [19, 33, 48, 50, 57, 184]. Вероятно, при фиброзировании, активации склеротических процессов, наблюдающихся у пациенток с трубноперитонеальным бесплодием, процессы отставания роста эндометрия и нарушения внутриэндометриальной перфузии происходят синхронно и тесно связаны между собой.

Кроме того, у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием в эндометрии происходит уменьшение экспрессии прогестероновых рецепторов в фазу секреции [20]. В настоящее время доказано, что решающую роль в имплантации играет не столько абсолютное содержание стероидных гормонов, сколько количество функционально полноценных рецепторов эндометрия к соответствующим стероидным гормонам [49].

Механизмы повреждения эндометрия у пациенток с бесплодием неясного генеза малоизучены и, по всей видимости, находятся под влиянием аутоиммунных комплексов, эндотелиопатий, процессов активации

свертываемости крови в местах предполагаемой имплантации вследствие активации процессов свертывания крови и др. [15, 36, 45, 106, 168]. Наследственный полиморфизм генов предрасположенности к развитию тромбофилии широко распространен среди пациенток с неудачными попытками ЭКО и способствует более частой и выраженной активации внутрисосудистого свертывания [35]; в нашем исследовании у 96,7% женщин с бесплодием неясного генеза отмечались в анамнезе неудачные попытки ЭКО. Вместе с этим ряд авторов связывает наличие генетических форм тромбофилии, особенно в сочетании с АФС, с причиной клинически не диагностированных ранних преэмбрионических потерь [8].

В нашем исследовании мы проводили определение полиморфизма 4 генов развития тромбофилии - G1691A гена V фактора свертывания крови, 020210А гена протромбина, 675 5G/4G гена PAI-1, С677Т гена MHFFR.

При анализе распределения генотипов нами были выявлены мутации гена V фактора свертываемости (фактор Лейдена) только у пациенток с бесплодием неясного генеза (11,6% в гетерозиготной форме и 1,6% в гомозиготном варианте генотипа); мутация гена протромбина была диагностирована у трех пациенток (в гетерозиготной форме) - 8,3%. В то же время ни у здоровых женщин, ни у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием данные мутации не были обнаружены. В литературе существует не так много работ, посвященных взаимосвязи мутации Лейдена и развития бесплодия. S. N. Bare исследовал 128 женщин с мутантными аллелями в генотипе и выявил, что риск развития бесплодия у них выше по сравнению с пациентками без Лейденской мутации в генотипе в 1,5 раза [75]. Существуют и противоположные мнения исследователей, считающих, что у носителей Лейденской мутации вероятность наступления беременности в 2 раза выше при циклах ВРТ, чем в популяции, что, возможно, объясняется важным для успешной инвазии бластоцисты условием эффективного тромбирования сосудов в месте имплантации [103].

При исследовании гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) нами обнаружено, что полиморфизм как в гетерозиготной форме, так и в гомозиготном варианте встречался практически с одинаковой частой во всех группах: I группа 46,1% и 11,8%; II группа - 40,1% и 16,7%; контроль - 42,5% и 15% (p>0,05).

Мы не выявили также различий в распространенности полиморфизма 675 4G/5G в гене PAI-1: гетерозиготные полиморфизмы встречались у 44,7% и 46,7% в группах с бесплодием (трубно-перитонеальное, неясного генеза, соответственно) и у 32,5% фертильных пациенток (p>0,05). То же касается и гомозиготных форм полиморфизма, частота встречаемости которых достоверно не различалась (p>0,05): 25,0% в I группе, 30,0% во II и 20,0% в контрольной группе. Наши результаты соответствуют средней частоте встречаемости полиморфизма 675 5G/4G в популяции и у женщин с неудачными попытками ЭКО. По данным Т. А. Охтырской, полиморфный аллель 675 4G выявляется у 77,7% пациенток с 2-мя и более неудачными попытками ЭКО в анамнезе, кроме того показано, что у них отмечается высокий уровень белка PAI в эндометрии и, с другой стороны, развивается ингибирование фибринолиза, что может быть причиной нарушения имплантации [35]. К тому же известно, что полиморфизмы генов MTHFR и PAI-1 преобладают среди причин развития тромбофилии у пациенток с ранними эмбрионическими потерями [37].

Анализируя данные генотипирования у наших групп пациенток, мы выявили наиболее неблагоприятные (с высоким риском тромбофилии) сочетания форм полиморфизмов - наличие мутаций аллелей генов протромбина и V фактора, а также сочетание гомозиготных форм полиморфизма генов PAI 675 4G/5G и MTHTR C677T. Данные

полиморфизмы в мировой литературе связывают с высоким риском развития нарушения процессов имплантация и развития беременности [35, 148].

Наиболее часто генотипы с высоким риском развития мультигенной тромбофилии были отмечены у пациенток с бесплодием неясного генеза (35,0%), что достоверно отличалось от контрольной группы и группы с трубно-перитонеальным бесплодием (p0,05), что косвенно является подтверждением данных, полученных С. Goodman, касающиеся повышенного риска нарушений процесса имплантации у женщин-носителей аллеля -1154А [120].

Биологическое действие VEGF реализуется путем связывания с рецепторами, из которых наиболее значимым является KDR, поскольку он опосредует основные эффекты VEGF, включая стимуляцию процессов ангиогенеза, сосудистой проницаемости и клеточной пролиферации. Исследователями замечено, что носительство полиморфных аллелей -604С и 1719Т гена KDR связано с выраженным снижением уровня продукции данного рецептора и нарушением его способности связываться с VEGF [188, 196].

Распределение генотипов этих двух полиморфизмов у контрольной группы и в группе пациенток с бесплодием неясного генеза не различалось, что, по нашему предположению, может свидетельствовать об отсутствии прямой взаимосвязи между изменением уровня продукции рецептора KDR, его способности к связыванию с VEGF и нарушением имплантационных свойств эндометрия.

Другой группой ангиогенных факторов, присутствующих в эндометрии, являются ангиопоэтины. В частности ангиопоэтин-2, являясь основным ростовым фактором, участвует в ремоделировании сосудов, вызывает уменьшение взаимодействия эндотелиальных клеток с внеклеточным матриксом и друг с другом, что стимулирует активность VEGF [159]. В тоже время отмечено, что если VEGF отсутствует, то ангиопоэтин-2 способствует регрессии сосудов; в присутствии же этого фактора роста ангиопоэтин-2 стимулирует ангиогенез [145 ].

Анализ результатов исследования частоты встречаемости генотипов ангиопоэтина-2 выявил тенденцию к большей частоте встречаемости (почти в два раза) гомозиготного полиморфного генотипа А735А у пациенток с бесплодием неясного генеза (15,0%) по сравнению с фертильными женщинами (7,5%). Данные различия недостоверны, однако могут указывать на некоторое участие этого фактора в нарушении функции эндометрия.

Нами было выявлено, что частота встречаемости полиморфизма генов нарушения ангиогенеза выше у пациенток с бесплодием неясного генеза по сравнению с фертильными женщинами. Полиморфные аллели в гетерозиготной форме встречались только в двух генах у 15,0% пациенток контрольной группы, тогда как у 61,5% пациенток с бесплодием гетерозиготные генотипы выявлялись в двух и более генах, а у 10,3% выявлялись полиморфные аллели в гомозиготном виде.

В дальнейшем нами был изучен характер внутриматочной перфузии с учетом отсутствия/наличия значимых полиморфизмов (подгруппы IIc и IId) и проведена оценка уровня внутриматочной перфузии для выявления клинических проявлений. Существенных различий между группами при оценке кровотока на уровне главных маточных и радиальных артерий нами выявлено не было, тогда как нарушения внутриматочной перфузии на уровне спиральных и базальных артерий эндометрия отмечены 76,9% пациенток в IIc группе и у 30,8% пациенток IId группы (различия статистически достоверны, p