Методы изучения клеточного и гуморального иммунитета

Иммунологические исследования выполнены на базе иммунологической лаборатории МУЗ ГКБ N 5 «МедВАЗ» г.Тольятти (завлабораторией Алпатова Т.А.).

Методы исследования согласно рекомендациям ВОЗ, включали в себя:

1.

2. Оценку содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов классов A, G, M методом радиальной иммунофиффузии;

3. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов при осаждении полиэтиленгликолем.

Идентификация лимфоцитов и их субпопуляций. Выделение мононуклеарных клеток из гепаринизированной крови осуществляли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1,077г/см³) по методу А.Воушп. Жизнеспособность выделенных клеток, оцененная в реакции с трипановым синим, составляла 94-96%. Идентификацию лимфоцитов и их субпопуляций проводили методом реакции иммунофлюорисценции с моноклональными антителами фирмы «Сорбент» (Москва). Реакция осуществлялась следующим образом: 1,0±0,1 млн. мононуклеарных клеток в объеме 50 мкл вносили в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. К клеткам добавляли 5 мкл тестируемого моноклонального антитела и инкубировали 30-45 минут при +4°С. Дважды отмывали клетки от несвязывающихся моноклональных антител центрифугированием стандартном растворе Хенкса при режиме вращения центрифуги 200g в течение 5 минут. К осадку отмытых клеток добавляли 5 мкл F(ab)₂ - фрагментов овечьих антител к иммуноглобулинам мыши, меченных красителем ФИТЦ и разведенных 1:100 растворителем Хенкса. Клетки суспензировали и инкубировали в течение 30 минут при +4°С. Иммунофлюоресценцию клеток оценивали на люминесцентном микроскопе «Люмам - ПР», подсчитывая процент флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом процента флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля .

Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови.

Содержание иммуноглобулинов класса A, G, М, продуцируемых B- лимфоцитами, рассчитывали с помощью метода радиальной иммунодиффузии по G. Manchini с помощью моноспецифических сывороток Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов. Измеряли диаметр кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки агарового геля, содержащего предварительно растворенную (диспергированную) моноспецифическую сыворотку. Содержание иммуноглобулинов в исследуемой крови определяли по калибровочной кривой, выражающей зависимость между уровнем иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации стандартной сыворотки человека.

Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови. ЦИК представляет собой химически связанные антитела, антигены и комплемент, основная функция которых заключается в обеспечении выведения (элиминации) антигенов из крови.

Оценку содержания ЦИК проводили с помощью тест - наборов производства «Реакомплекс» на основе метода нефелометрии различной растворимости мономеров иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000). В контрольную пробирку вносили 0,2 мл разведенной 1:2 боратным буфером (pH 8,4) сыворотки и 1,8 мл 3,75% ПЭГ-6000. Выдерживали 2 часа при комнатной температуре. Оценку результатов производили с помощью анализатора иммуноферментных реакций АИФР-01 «Униплан ТМ» на длине волны 440нм. Понижение значения оптической плотности при регистрации показателя ЦИК свидетельствовало о повышении его уровня в крови.

2.6