Изучение биораспределения и метаболизма фуллеренов в экспериментах in vivo

Изучение фармакокинетики фуллеренов в условиях in vivoпосле воздействия через легкие, кишечник и кожу, представляет собой актуальную, отдельную и весьма сложную задачу необходимую для полноценной характеристики биологического действия этих веществ на живые организмы, включая выявление потенциальных органов-мишеней, установление возможности проникновения через барьеры организма, накопления, и метаболизма.

а, самое главное, размеры его частиц, имеют немаловажное значение для оценки биологического действия, в т.ч. распределения фуллерена по органам и тканям [18].

В работе [176]была изучена фармакокинетика водорастворимых производных фуллеренов с целью оценки их потенциала в качестве лекарственных средств. Для получения данных о пероральной абсорбции, распределении и выведении этих соединений в реакции с замещенным метиленциклопропаном и ангидридом янтарной кислоты было синтезировано ¹⁴С- меченное растворимое в воде сукцинильное производное фуллерена С60. После перорального введения крысам, это соединение было относительно мало биодоступно. Всасывание из единичной введенной дозы составило около 3%; основная часть метки накапливалась в печени. До 97% модифицированного фуллерена выводилось из организма с калом. При внутривенном введении [¹⁴С]фуллерен распределялся в различных тканях, и большая его часть сохранялась в организме спустя неделю. Наибольшее накопление метки установлено в печени - до 91% через 16 часов после введения. Очень небольшие количества радиоизотопного индикатора (не более 0,9% через 8 часов) выявлялись в мозге, что, по мнению авторов, означало проникновение через гематоэнцефалический барьер.

Метод получения водорастворимого радиоизотопно меченного металлофуллерена представлен в работе [37]. Использовали эндоэдральный

аддукт фуллерена с гольмием HOx@C82 (где х=1,2), который очищали и дериватизировали с получением водорастворимого производного HOx@C82(OH)_y. После проведения нейтронной активации этого соединения был получен радиоактивный ¹⁶⁶HOx@C82(OH)y, распределение которого изучали после внутривенного введения мышам линии BALBc в течение 48 часов. Результаты сравнивали с контрольным соединением - низкомолекулярным металлохелатным комплексом Na₂[¹⁶⁶Ho(DTPA)(H₂O)]. Показана селективная локализация ¹⁶⁶Ho_x@C₈₂(OH)_yв печени с медленным выведением, а также его поступление в кости без элиминации. В противоположность этому, экскреция с мочой и калом контрольного соединения была количественной через 1 час. В этой же работе был также изучен метаболизм ¹⁶⁶Но_х@С₈₂(ОН)_у на крысах линии Фишер. Результаты показали, что до 20% [¹⁶⁶Ho]меченного эндоэдрального фуллерена выводится в неизмененном виде, что было подтверждено хроматографическим методом.

Авторы работы [58]изучали влияние фуллерена C₆₀на острую токсичность CCl₄, а также исследовали кинетику накопления и выделения, а также распределения фуллерена C₆₀в печени крыс.

в печени. Характерные частицы фуллерена С_б0 были обнаружены с помощью ПЭМ во всех срезах печени, в том числе внутри клеток Купфера (рис. 2B и 2С) и капсулах некоторых гепатоцитов, а также внутри редких звездчатых клеток, локализованных в пространствах Диссе. Большинство агрегатов, выявленных внутри клеток печени, представляли собой кристаллы фуллерена Сбо со средним размером менее 50 нм (рис.2В). В ряде случаев отмечали появление фуллерена внутри капелек липидов (рис. 2D). В целом, по мнению авторов, полученный результат свидетельствует о том, что фуллерен хорошо поглощается органами. Однако, для получения достаточного и воспроизводимого накопления фуллерена в печени, было необходимо его введение в больших дозах (2 г/кг массы тела).

Рисунок 2. Электронная микроскопия (по данным работы [58]).

Сканирующие электронные микрофотографии водной суспензии микронизированного С_б0 используемые в данном исследовании; (B-D) ПЭМ микрофотографии срезов печени крыс, получавших Сбо: B - кластеры Сбо (указано стрелками) внутри клеток Купфера; С - кластеры Сбо в клетках Купфера, размер около 50 нм; D - растворение С_б0 внутри липидных капель.

Авторы работы [28]не обнаружили фуллерены в крови, после их ингаляции крысам, предполагая, что это происходило из-за потенциальной биотрансформации этих веществ в легких и недостаточной чувствительности метода обнаружения.

Исследование [122]описывает впервые процедуру введения радиоактивной метки в нанокристаллы фуллерена С60 (raroC60) с использованием Na¹²⁵I, а также биологическое распределение меченного [¹²⁵I]-наноC₆₀после внутривенной инъекции крысам. Одновременно, с использованием метода фотонно­корреляционной спектроскопии и ПЭМ была идентифицирована кристаллическая структура частиц [125I]

-наноC6о со средним диаметром 200-250 нм. [¹²⁵I]-наноC6о имел особенно высокое сродство к человеческому сывороточному альбумину, 95% степень связывания с которым достигалась уже через 1 час после введения. Исследования биораспределения [¹²⁵I]-наноC6о на крысах показали значительные различия в накоплении в тканях [^Ц-нано^о и используемого в качестве контроля низкомолекулярного радиоактивного индикатора Na¹²⁵I. Наибольшее накопление радиоактивной метки наново наблюдалось в печени и селезенке, в то время как накопление в щитовидной железе, желудке, легких и кишечнике было значительно ниже по сравнению с Na¹²⁵I .

В работе [26]для исследования биораспределения были взяты 4 группы по 3 крысы (массой 200±20 г), которым в течение 7 дней вводили суспензию С₆₀ в оливковом масле (0,8 мг/мл) в одинаковой дозе (4 мг/кг массы тела) либо интраперитонеально (2 группы), либо через желудочный зонд (2 группы). На 1-й и 8-й день после введения, содержание фуллерена определяли методом ВЭЖХ в крови и органах.

принятой дозы при введении перорально, в то время как это значение превосходило 0,12% после интраперитонеального введения. Микроскопическое исследование ретикуло-эндотелиальной системы селезенки на 8-й день показало наличие некоторых скоплений фуллерена C60, которые больше по размеру и многочисленнее после введения интраперитонеально, чем после перорального приема. Таким образом, концентрация фуллерена C60, достигавшаяся в селезенке, была выше предела его растворимости. Напротив, в печени во всех случаях не наблюдали отложений фуллерена, то есть его концентрация в этом органе была недостаточно высока, чтобы вызвать отложения кристаллов.

В недавнем исследовании [157], для получения данных о возможной пероральной токсичности фуллерена Сб0 и изучения его биораспределения, крысам линии Sprague-Dawleyежедневно вводили диспергированный в кукурузном масле фуллерен С60, через желудочный зонд в дозах 1, 10, 100 и 1000 мг/кг/день в течение 29 дней с последующим 14-дневным периодом восстановления. Ни в одной из групп не наблюдалась смертность животных, а также отсутствовали различия с контролем в результатах клинических наблюдений, приростах массы тела и потреблении пищи. Более того, отсутствовали гистопатологические изменения во всех исследованных органах в конце периода введения фуллерена, а также в конце периода восстановления. Как у самцов, так и у самок в группе получавшей 1000 мг/кг/день наблюдались черноватые фекалии, черное содержимое желудка и толстой кишки.

В исследовании [43]использовали ¹³C стабильную изотопную метку для количественного определения фуллерена in vivo.¹³C меченый фуллерен C₆₀ диспергировали в воде c Твин 80 для внутривенной инъекции животным, затем

количественно определяли фуллерен с помощью изотопного отношения при масс- спектрометрии. Результаты показали, что С₆₀ быстро выводится из кровообращения с периодом полувыведения 14 минут и селективно накапливается в печени, селезенке и легких, с небольшим снижением содержания в течение 24 часов. Фармакокинетика фуллерена C₆₀может быть оценена с помощью двухкамерной модели, в которой происходит его быстрая элиминация из кровотока и медленное выведение с поглощением тканями.

В ряде работ был исследован вопрос о возможных продуктах биотрансформации и метаболизма фуллеренов.

Авторы работы [114] установили, что фуллерен С60 образует в печени крыс комплексы с витамином А. Эти данные подтверждаются в работе [58], где на хроматографических профилях экстрактов печени крыс получавших фуллерен С60, были идентифицированы некоторые дополнительные пики, элюирующиеся между пиками, соответствующими ретиниловым эфирам и пиком фуллерена С60, которые отсутствуют в экстрактах печени контрольных крыс. Эти результаты свидетельствуют о возможном выведении фуллерена С60 при участии продуктов обмена ретинола. В уже упоминавшейся работе [28], в эксперименте с ингаляционным воздействием, авторы исследования не обнаружили фуллерен С60 в крови, но не исключают возможность его биотрансформации под действием альвеолярных макрофагов или при мукоцилиарном транспорте.

В работе [126]была показана возможность метаболизации немодифицированного фуллерена С₆₀ клетками низших грибов Epicoccum nigrum и Pestalotia heteromorphaв культуре. Точный состав образующихся гидрофилизованных производных фуллерена авторами работы определен не был. Вместе с тем, как можно судить по данным изучения процессов окисления фуллерена в модельных системах in vitro[60], в числе преобладающих продуктов этого процесса могут быть его гидроксилированные производные.

Таким образом, вопрос о биотрансформации фуллеренов и о составе образующихся производных в литературе исследован недостаточно, что связано с

большими методическими сложностями, возникающими при решении данной проблемы.

2.5