ГЛАВА 6. ПЛАЗМИДЫ

Плазмиды (эписомы, экстрахромосомные генетические до­мены) до сих пор большинство микробиологов не относят к царству вирусов, хотя вирусологи говорят о персистенции па­пилломавирусов в виде эписом, об эписомах герпесвирусов и даже и двунитевыХ киллерах дрожжей как об эписомах.

никто не сомневается. Неспособность к самостоятельной реп­ликации свойственна многим вирусам-сателлитам, дефектным вирусам и фактически всем ДНК-co держащим вирусам.

Отсутствие существенных различий между вирусами и плаз­мидами было показано на модели сателлитного фага P4 [Gold­stein R. et al., 1982]. Он реплицируется в .присутствии фага- помощника Р2, который обеспечивает его необходимыми ген­ными продуктами, включая капсидные белки. Этот фаг может также размножаться в отсутствие помощника как профаг, ин­тегрированный в геном Е. coll.Он, наконец, может размно­жаться как плазмида. Эти данные указывают на близость между дефектными вирусами и плазмидами.

К самостоятельной репликации не способны целые группы вирусов, например, парвовирусы-сателлиты, которые реплици­руются только в присутствии адено- и герпесвирусов, дельта­вирус, размножающийся только в присутствии гепаднавиру- сов. Многие онковирусы являются дефектными по гену рої, кодирующему синтез полимеразы, и репликация их возможна лишь в присутствии близкородственного вируса-помощника, имеющего полноценный геном.

Наконец, следует напомнить, что все ДНК-содержащие ви­русы, за исключением вирусов оспы, лишь частично реплици­руют геном собственными ДНК-полимеразами. Сложный ме­ханизм синтеза их ДНК обеспечивается системой клеточного синтеза ДНК даже у вирусов с большим геномом (герпесви­русы), а у вирусов с небольшим геномом (лаповавирусы) вклад собственных факторов синтеза ДНК минимален.

Далеко не все вирусы имеют собственные вирионные бел­ки, в которые упакован геном. Кроме уже упомянутого сател­лита фага Р4, назовем дельта-вирус, имеющий собственный капсид, а его внешняя оболочка «составлена» из структуры вируса гепатита В. Многие из онковирусов, дефектных по ге­нам env,получают оболочку размножающего их полноценного вируса. Этот феномен, обозначенный как образование псевдо­типов, легко воспроизводится экспериментально и, по-видимо­му, существует в природе. В частности, таким путем удается получить вирионы, содержащие генетический материал онко­вирусов и оболочку вируса везикулярного стоматита. Более того, при несбалансированных синтезах в субклеточных фрак­циях образуются структуры, содержащие генетический мате­риал вируса и оболочки из клеточных белков [Жданов В. М. и др., 1970].

Противопоставление вирусов, плазмид и других экстрахро- мосомных автономных генетических структур теряет смысл в свете экспериментов по генетической инженерии. Плазмиды удается конструировать из бактериальных вирусов и даже из хромосомных элементов клетки. Так, V. Zakian и J. Scott (1982)

сконструировали плазмиду TRPI Rl circle,целиком состоящую из 1453 пар нуклеотидов дрожжевой хромосомной ДНК- Эта ■плазмида реплицировалась в дрожжевых клетках до 100— 200 копий на клетку с помощью продуктов генов, ответствен­ных за репликацию дрожжевой ДНК- Авторы считают источ­никами возникновения плазмид последовательности дрожже­вой ДНК, называемые автономно реплицирующимися после­довательностями (ARS). Поэтому сконструированная плазми­да является хорошей моделью для изучения репликации дрож­жевой ДНК.

О возможном клеточном происхождении некоторых плаз­мид свидетельствуют данные исследований митохондриальной плазмиды грибов Neurospora.Эта плазмида имеет длинную открытую рамку считывания, кодирующую гидрофильный бе­лок (его молекула состоит из 710 аминокислотных остатков и по организации весьма сходна с интронами митохондриаль­ной ДНК I группы) [Nargand F. et al., 1984].

Как и ординарные вирусы, плазмиды легко преодолевают барьеры даже таких эволюционно далеких таксономических групп, как бактерии и дрожжи (про- и эукариоты). Получены гибридные плазмиды бактериального происхождения, эффек­тивно реплицирующиеся в дрожжах и вызывающие их транс­формацию. Сконструированы плазмиды из ДНК вируса бычьей папилломы и pBP322,которые реплицируются в мышиных и бактериальных клетках. Сконструирована плазмида из ДНК хромосом мышиных клеток, которая оказалась способной реп­лицироваться в дрожжах [Roth G. et al., 1983].

Со времени открытия, вернее, понимания природы плазмид [Jacob F., Wollman E., 1958] им посвящена громадная лите­ратура, в том числе монографии. Поэтому нет никакой надоб­ности сколько-нибудь подробно, описывать многочисленные естественные и искусственно созданные плазмиды. Отметим лишь, что обычно это двунитевые циркулярные молекулы ДНК. Основными группами плазмид по функциональному признаку являются колициногенные факторы, факторы фер­тильности, факторы устойчивости к лекарственным веществам. Однако существуют и другие группы плазмид, о которых бу­дет сказано ниже.

Половая гибридизация бактерий, являющихся гаплоидны­ми организмами, связана с особой группой плазмид, назван­ных факторами фертильности [Cavalli-Storza L. et al., 1953]. Фактор фертильности, т. е. плазмида, может находиться в клетке как ,в автономном, так и в интегрированном состоянии, и именно в этом виде он обеспечивает половой процесс, т. е. обмен генетическим материалом. Колициногенные, или шире — бактериоциногенные, факторы также являются плазмидами, на которых закодированы белки, обладающие токсигенными

свойствами для соответствующих бактерий [Gratia А., 1925].

Вирулентность энтеробактерий и вибрионов также связа­на с 'плазмидами (соответственно, pColV-K30и pJM,Γ),кото­рые обеспечивают усвоение железа, что необходимо для ин­тенсивного размножения бактерий. Несмотря на сходство функций, обе плазмиды не обладают гомологией ДНК [Wal­ter М. et al., 1984].

На модели плазмиды pHW400,имеющей молекулярную массу 6?10^δ, с которой связана вирулентность дизентерийной шигеллы, было показано, что она кодирует белок с молеку­лярной массой 41 000. Он участвует в формировании специфи­ческой боковой цепи липополисахарида, одного из факторов вирулентности [Watanabe Т. et al., 1984]. Другая плазмида (молекулярная масса 140?10⁶) обеспечивает проникновение бактерий в клетки.

У чумной палочки и других Yersinia (pestis, enterocolitica, pseudotuberculosis'}имеются плазмиды, .обеспечивающие их вирулентность. Эти плазмиды кодируют белки наружных мем­бран бактерий, в частности К-антиген, с которым связана ви­рулентность бактерий этого рода [Portnoy D. et al., 1984]. Многие токсины (экзотоксины) кодируются плазмидами, в частности термолабильный энтеротоксин кишечной палочки, сходный с холерным энтеротоксином, и дифтерийный токсин, который могут ’вырабатывать разные виды Corynebacterium (diphtherlae, ulcerans, pseudotuberculosis) [Wong T., Gro- man N., 1984].

Имеются также основания считать, что токсинообразова- ние сибиреязвенной бациллы связано с плазмидой [Mikesell Р. et al., 1983]. Выработка токсинов у Bacillus Ihuringiensis обусловлена наличием у них плазмид. У этого вида бактерий обнаружено 6 плазмид с молекулярной массой от 3,6?10⁶до 105? IO⁶. Таким образом, наиболее крупные плазмиды имеют ДНК, характерную для крупных фагов. Токсичность для ко­маров связана с одной из этих плазмид, ρTX14-3.Плазмиды обусловливают продукцию токсина Bacillus anthracis.Виру­лентность нефропатогенных штаммов кишечной палочки и инвазионные свойства Shigella flexneriтакже связаны с плаз­мидами.

Значительное число плазмид передает бактериям устой­чивость к лекарственным веществам, в том числе множест­венную устойчивость к антибиотикам. Природа этого ^-фак­тора оказалась разной: в одних случаях лекарственная устой­чивость трансдуцирована умеренными фагами, в большинстве

же случаев — плазмидами, как автономными, так и интегра- бельными [Watanabe T., 1963]. В основе действия этого фак­тора лежит синтез ферментов, модифицирующих или инакти­вирующих соответствующие антибиотики.

Плазмиды устойчивости к антибиотикам могут реплициро­ваться в разных видах. Так, плазмида pBC16устойчивости к тетрациклину и плазмида устойчивости к хлорамфениколу (молекулярная масса соответственно 28?10^δи 18?10⁶) легко передаются разным видам Bacillus (anthracis, cereus, thurin- giensis),особенно в присутствии трансдуцирующего фага СР-51[Ruhfel R. et al., 1984]. C помощью плазмид ген устой­чивости к ампициллину (ген β-πaκτaMa3bi) Staphylococcus aureusбыл передан Bacillus subtilisпри интеграции его в хро­мосому [Saunders С. et al., 1984]. В настоящее время можно считать также доказанным, что образование опухолей у расте­ний («корончатые галлы») связано с интеграцией 7ї-іплазми- ды Agrobacterium tumefaciens,несущей ген J,в хромосомы поражаемых растений. При этом «хозяйская» специфичность определяется особыми множественными генами.

Образование «корончатых галлов» у двудольных растений является сложным процессом взаимодействия генетического материала про- и эукариот. Этот процесс вызывается грамот- рицательными бактериями — носителями Ti (tumor-inducing) плазмид, часть ДНК которых, Т-ДНК (transfer DNA),перено­сится в растительные клетки и интегрирует с их геномом. Та­ким образом, образование опухолей растений, как и опухолей животных, связано с интеграцией чужеродного (в данном слу­чае плазмидного) генетического материала. Сходные процес­сы вызываются в корнях растений («бородатый корень») при переносе в них плазмид Ri Agrobacterium rhizobium.

Плазмиды Tiу разных штаммов варьируют по величине генома (от 90?10^δдо 160?10^δ). Их можно разделить на три^- типа: кодирующие метаболизм октопина и атропина, кодирую­щие метаболизм попилина, ориолина и агроцианинов, коди­рующие метаболизм только агропина. Эти вещества утилизи­руются клетками агробактерий в качестве источника углерода и азота, поэтому их метаболизм зависит от плазмид, содержа­щих соответственные гены, а опины (производные аминокис­лот) в свою очередь продуцируются клетками «корончатых галлов». Таким образом, растения, бактерии и плазмиды пред­ставляют собой сложную трехчленную симбиотическую систе­му, в которой явные «выгоды» имеют бактериальные и вирус­ные партнеры.

Структурный ген для мРНК октопин-синтазы находится в центральной части плазмиды Tiи экспрессируется в расти­тельных клетках. Молекулярная масса октопин-синтазы со­ставляет около 40 000 [Murad N., Kemp J., 1982].

Между прочим, при изучении плазмиды Tiи вызываемых ею опухолей показана возможность рекомбинации ДНК про- и эукариотов в естественных условиях. Сходные явления проис­ходят при взаимодействии плазмид Agrobacterium rhizogenes, вызывающих заболевания корней дикотиледоновых растений (плазмидная ДНК интегрирует с ДНК. клетки) [Chilton М. et' al., 1982].

Происхождение плазмид неоднократно обсуждалось и наи­более общепринятое мнение заключается в том, что плазмиды являются дериватами фагов. Это подкрепляется данными о сходстве действия колицинов и белков отростков фагов, спо­собности передавать устойчивость к антибиотикам как фагами, так и плазмидами, наконец, о возможности искусственно пре­вращать фаги в плазмиды. Однако, соглашаясь с этим заклю­чением, следует также принять и другое объяснение — воз­можность возникновения плазмид из бактериальных хромо­сом. Экспериментально это, как уже упоминалось, было не­однократно воспроизведено. Можно предположить поэтому, что ряд плазмид произошел именно таким образом. В част­ности, это относится к плазмидам класса R.Соседствуя с гри­бами, вырабатывающими антибиотики, бактерии могли в ходе эволюции образовать гены, кодирующие ферменты, которые разрушают или модифицируют антибиотики. Однако не всег­да этот дополнительный генетический «груз» был необходим, и бактерии могли освободиться от него, вычленив соответ­ствующие гены из хромосомы. Для их размножения было не­обходимо в соответствующей (обычно кольцевой) структуре иметь сайт начала репликации. Ставши автономными, такие генетические структуры подвергались действию законов эво­люции и, возможно, от них произошли некоторые обычные вирусы.

Плазмиды обычно находятся в свободном состоянии, они связаны с бактериальными хромосомами, однако могут быть и интегрированы (частично или полностью) в бактериальные хромосомы. Так, плазмида pMC7105 Pseudomonas Syringae (150 кб) встраивается в бактериальную хромосому, а при вы­резании ее фрагментов из хромосомы образуется несколько мелких плазмид [Szabo L., Mills D., 1984].

Существуют плазмиды с широким спектром «хозяев», на­пример, плазмиды несовместимости группы P (IncP^y),которые могут стойко поддерживаться в любом виде грамотрицатель- ных бактерий. К ним близки плазмиды RK2и другие из этой группы (Pl, RP4, R68, R18, R751).При изучении плазмиды К2 было показано, что она кодирует три летальных для «хо­зяина» гена (kit),которые регулируются специальным геном (kor^y)этой же плазмиды [Young С. et al., 1984].

О быстроте эволюции плазмид можно судить по появлению

структур, разрушающих синтетические вещества. Так, неко­торые флавобактерин содержат плазмиды, разлагающие оли­гомер нейлона. Циклический димер 6-аминогексаноевой кис­лоты (нейлон) разрушается с помощью гидролазы, закодиро­ванной в плазмиде [Negoro С. et al., 1984].

Плазмиды — мощные факторы адаптации микробов к не- ■ благоприятным условиям среды. Они и другие внехромосом- ные факторы наследственности вносят вклад в изменчивость геномов бактерий. Взаимодействие плазмид и их отдельных генов с транспозонами приводит к встраиванию новых генов и влияет на эволюцию микроорганизмов. Но вклад в уже ди- вергировавшие виды невелик. Имеются силы, удерживающие гены в хромосомах и плазмидах. В табл. 5 приведены неко­торые функции, обеспечиваемые плазмидами [Хмель И. X., 1985]. В обзоре И. X. Хмеля рассматриваются как источники

Таблица 5. Биологические функции, определяемые плазмидами

¹Приведены плазмиды, определяющие указанную функцию. Плазмиды, для ко­торых ие указаны «хозяева», обычно встречаются (или могут существовать) в клет­ках Е. colt.

происхождения плазмид фаги (например, плазмида λdvиз фага λ), бактериальные хромосомы (от них происходят коли- цины). В этом смысле плазмиды и вирусы могут иметь общее происхождение. C этой точки зрения представляет интерес изучение систем, в которых сосуществуют плазмиды и фаги, функционально сходные (например, системычхолерных вибрио­нов). Эволюционное значение их многообразно и рассмотрено в этой главе лишь частично.

Таким образом, прионы, вироиды и плазмиды являются как бы начальными стадиями формирования вирусов. Срав­нительное их изучение позволяет понять возможные источни­ки происхождения двух больших групп вирусов — ДНК- и РНК-содержащих.