Вирусная инфекция эндотелия

Среди многочисленных агентов, способных провоцировать про- воспалительные изменения сосудистой стенки, наибольшее внимание привлекают агенты вирусной природы, в частности, герпесвирусы [Robertson et al, 1995; Nicholson, Hajjar, 1998].

7.1.Структурно-функциональные признаки вирусной инфекции в культивируемых ЭК человека

Рисунок 48.

Цитопатическое действие вируса простого герпеса I типа в культуре ЭК человека.

Фазовый контраст, X 200.

Наиболее характерным признаком вирусной инфекции ЭК, вызванной ВПГ-1, и выявляемым при обычной микроскопии инфицированных культур, является развитие, так называемого, цитопатического действия (ЦПД). В зависимости от титра добавленного инфекционного агента (или множественности инфицирования, М/И), первые признаки ЦПД выявляются уже через 24-72 часа, времени,

необходимого для внутриклеточного накопления вирусных частиц.

Подобное, очаговое, развитие ЦПД в монослойной культуре ЭК не связано с избирательным инфицированием отдельных клеток. Это доказывают результаты выявления ранних вирусных антигенов через 24 часа после инфицирования различными дозами вируса: при М/И, равной 0.01-0.1, вирусные антигены выявляются в ядрах 95-98 % клеток (Рис. 49 А).

Рисунок 49.

Экспрессия ранних (А) и поздних (Б) вирусных антигенов в ядрах и цитоплазме ВПГ-1 - инфицированных ЭК человека на стадиях до развития морфологических изменений и ЦПД, соответственно. Иммунопероксидазная техника, Х350.

В последующие 24-48 часов ранние вирусные антигены практически исчезают из инфицированных ЭК, уступая место поздним вирусным антигенам. Динамика их исчезновения соответствует динамике развития ЦПД от центра к периферии очага инфекции (Рис. 48). Клетки, расположенные в центральных областях очагов практически не содержат ранних антигенов, но заполнены поздними белками, входящими в состав вирусного нукпеокапсида (Рис. 49 Б).

Параллельно с развитием ЦПД и разрушением клеток вследствие литического повреждения, вирус попадает в культуральную среду. Результаты измерения титра

ВПГ-1 в культуральной среде в зависимости от использованной множественности инфицирования представлены на рисунке 50.

Рисунок 50.

Нарастание титра вируса в культуральной среде при инфицировании ЭК различными разведениями ВПГ-1.

(TCID$o - концентрация вируса, вызывающая инфицирование 50% клеток тест-системы).

ВРЕМЯ, сутки

7.2. Экспрессия молекул клеточной адгезии ВПГ-1-инфицированными ЭК

С помощью иммуногистохимического окрашивания культур ЭК, инфицированных различными дозами ВПГ-1 и зафиксированных на разных стадиях развития инфекции, был выявлен ряд закономерностей. В первую очередь это относится к усилению экспрессии на поверхности инфицированных ЭК молекул клеточной адгезии семейства селектинов: Р- селектина и Е-селектина. Клетки, экспрессирующие на наружной мембране Р-селектин, выявляются уже через 24 часа с момента инфицирования, т.е. на самых ранних стадиях развития инфекции (Рис. 51). В дальнейшем, число Р-селектин-положительных ЭК возрастает и к моменту появления признаков ЦПД достигает нескольких процентов. Аналогичная картина выявлена и для Б-селектина. В случае обеих МКА данные иммуногистохимического окрашивания подтверждаются результатами проточной цитофлуориметрии (Табл. 7).

В отношении МКА других классов, в частности, ICAM-1 и VCAM-1, мы не смогли прийти к однозначному заключению. С одной стороны, при иммуногистохимическом окрашивании прикрепленных культур наблюдается видимое усиление окрашивания в клетках, претерпевающих цитопатические изменения, с другой — проточная цитофлуориметрия не показала изменения интенсивности флуоресценции отдельных клеток или изменения числа положительно окрашенных ЭК (Рис. 51, Табл. 7). По всей видимости, причиной подобного визуального эффекта можно считать ретракцию (ошаривание) клеток,

приводящее к увеличению плотности экспрессированных МКА на единицу поверхности, а не изменение их абсолютного количества.

Рисунок 51.

Экспрессия молекул клеточной адгезии ВПГ-1 инфицированными ЭК.

А - Р-селектин; Б - Е-селектин; B-VCAM-1; Д-ІСАМ-1.

л

Ч- л-

Иммунопероксидазная техника, Х350.

Таблица 7.

Изменение числа клеток, положительно окрашенных на МКА, при инфицировании ЭК вирусом простого герпеса I типа (48 часов после инфицирования при М/И 0.01).

7.3. Адгезия клеток периферической крови на инфицированный эндотелий

Как уже отмечалось в предыдущих разделах, контрольные монослойные культуры ЭК являлись практически не адгезивными для лейкоцитов (Рис. 52 А). Однако, в результате инфицирования ВПГ-t, в культуре появлялись, вначале - единичные клетки, а затем - клеточные кластеры, связывающие значительное количество клеток крови (Рис. 52 Б, В). Подобные группы выявлялись задолго до того, как появлялись первые признаки ЦПД, но в интервал времени, соответствующий обнаружению вирусных антигенов внутри и МКА на поверхности клеток. На более поздних стадиях развития ЦПД, адгезия лейкоцитов на ЭК снижалась и выявлялась преимущественно в периферических областях очагов инфекции, где клетки сохраняли распластанную форму, но нее в центральных зонах,

подверженных выраженным морфологическим изменениям, связанным с ЦПД (Рис. 52 Г).

Рисунок 52.

Адгезия лейкоцитов на ВПГ-1 - инфицированные ЭК.

А - контроль;

Б - группа внешне неизмененных ЭК с адгезировавшими клетками крови;

В-Г - начальная и продвинутая стадии развития ЦПД.

Окраска по Гимза. Х400.

Полученные данные свидетельствуют, что эндотелий приобретает про- воспалительный фенотип уже на самых ранних этапах развития вирусной инфекции, привлекая на себя и в субэндотелиальное пространство ядерные клеточные элементы крови и способствуя, таким образом, возникновению интимальных инфильтратов.

7.4. Влияние ГМК на развитие вирусной инфекции эндотелия.

В разделе 5 были рассмотрены эффекты кондиционированных сред, полученных от интимальных ГМК, и действие продуктов жизнедеятельности этих клеток в условиях со-культивирования на экспрессию различных классов эндотелиальных МКА. Учитывая тот факт, что многие из синтезируемых и секретируемых ГМК продуктов по данным литературы обладают активностью и в отношении некоторых вирусных инфекций, было проведено несколько серий экспериментов.

В первой серии были использованы условия совместного культивирования двух клеточных типов (ЭК и ГМК) в культуральной системе TransWell. Результаты одного из репрезентативных опытов представлены на рисунке 53.

На рисунке 53 А отчетливо видно, что результатом помещения в ячейку с инфицированным эндотелием вкладыша TransWell, засеянного ГМК, является существенное торможение репродукции ВПГ-1 в ЭК. Со-культивирование двух клеточных типов в течение 24 часов до инфицирования ЭК также приводило к снижению темпов накопления вируса в культуральной среде, но, обычно, менее выраженному, чем в случае со-культивирования с уже инфицированными клетками.

Со-культивирование инфицированных ВПГ-1 ЭК с диплоидными фибробластами человека не обладало активностью в отношении вирусной репродукции.

Рисунок 53.

Влияние интимальных ГМК на репродукцию ВПГ-1 в культивируемых ЭК человека.

А - в условиях со-культивирования; Б и В - при использовании КС-ГМК,

добавленной до, после и в процессе инфицирования (до и после). Множественность инфекции, М/И: А, Б- 0.01; В - 0.1.

В серии предварительных экспериментов, ГМК интимы аорты человека показали примерно такую же, как ЭК, способность быть инфицированными ВПГ-1 и поддерживать репродукцию вируса в условиях культивирования (Рис. 54).

0 12 3

ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, сут

Рисунок 54.

Репродукция ВПГ-1 в культивируемых ГМК интимы аорты человека в зависимости от использованной множественности инфицирования.

Для того чтобы исключить возможность инфицирования в процессе со- культивирования самих ГМК, следующая серия экспериментов была проведена с использованием сред, кондиционированных в течение 24 часов субконфлуэнтной культурой ГМК (КС-ГМК). Полученные данные показали, что КС-ГМК обладает выраженным тормозящим репродукцию вируса эффектом.

Иными словами, с помощью КС-ГМК удается достичь латенции вируса. Однако, латентная инфекиия ЭК, устанавливающаяся в результате культивирования клеток в КС-ГМК, является обратимой. Если через 3-4 суток культивирования в КС-ГМК такие, латентно инфицированные ЭК трипсинизировать, пересадить в новые ячейки и продолжать культивирование в стандартной (свежей) среде культивирования, то развитие (реактивация) инфекции будет происходить в них примерно с такой же интенсивностью, как если бы их заразили заново (Рис. 55 Б). Если же клетки (опытные и контрольные) после пассирования перевести на или продолжать культивировать в КС-ГМК, то не наблюдается ни нарастания титра вируса, ни появления признаков ЦПД.

Время после инфицирования (А) или пассирования (Б) контроль; til до: I I посла

Рисунок 55.

Влияние КС-ГМК на репродукцию ВПГ-1 в ЭК при низкой концентрации инфекционного агента (М/И 0.001).

А - в первично инфицированной культуре; Б - в культуре, как на блоке А, но после пассирования в соотношении 1:2 и продолжении культивирования в контрольной среде или КС-ГМК.

Известно, что ГМК, как in vivo, так и in vitro, способны синтезировать и секретировать во внеклеточной пространство достаточно высокие концентрации различных цитокинов и ростовых факторов. Наиболее представленными из них являются ИЛ-1, TNF-a, G-CSF и GM-CSF. В отношении части из этих соединений имеются сведения о возможной противовирусной активности (см. Обзор литературы). Это послужило основанием для проведения следующей серии экспериментов, в которой было исследовано влияние перечисленных субстанций на

Рисунок 56.

Секреция интерферона интимальными ГМК по сравнению с другими известными продуцентами.

репродукцию ВПГ-1 в описанной культуральной системе. Поскольку ГМК не продуцировали определяемых количеств интерферонов без дополнительной специфической стимуляции (Рис. 56), действие этих агентов не исследовалось. Результаты одного из серии проведенных экспериментов суммированы на рисунке

57.

TNF-a

G-CSF

Время после инфицирования

■■ контроль; ЕЭ 10ед(мк8)/нл; I 150^мл. ГОС?! ЮОикаЛ

Рисунок 57.

IL-1

Влияние цитокинов, ИЛ-1, TNF-a и G-CSF, на репродукцию ВПГ-1 в культивируемых ЭК человека.

Клетки инфицировались при М/И 0.01, указанные концентрации цитокинов добавлялись за 24 часа до инфицирования (А, В, Д) или сразу после инфицирования (Б, Г, Е).

Все три исследованных препарата обладали способностью тормозить репродукцию ВПГ-1, наиболее выраженной в первые двое суток после инфицирования клеток. Тем не менее, ни отдельные цитокины, ни их различные комбинации не обладали способностью полностью блокировать репродукцию вируса, как это было показано в случае КС-ГМК.

Таким образом, в данной части исследования были получены данные, позволяющие рассматривать интимальные ГМК, не только как возможный активатор про-воспалитсльных функций эндотелия через регуляцию экспрессии различных классов МКА, но и как мощный инструмент противовирусной защиты организма на уровне сосудистой стенки.

7.5. Продукция цитокинов ВПГ-1-инфицированны.ми ЭК

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что продукция цитокинов ЭК в культурах, полученных от разных доноров, может варьировать в

значительных пределах. Тем не менее, индивидуальные вариации не помешали установить, что ВПГ-1 является слабым индуктором продукции цитокинов эндотелиальными клетками. Продукция ИФН-альфа отмечалась редко и на низком уровне (2-4 Ед./мл), уровни ИЛ-1 и ИЛ-6 лишь немного превышали контрольные значения. Лишь некоторые культуры спонтанно продуцировали определяемые количества TNF-a; достоверного нарастания синтеза цитокина в инфицированных культурах выявлено не было. Сходным образом, не было выявлено изменений в продукции ЭК и ИЛ-8.

7.6.Продукция цитокинов лейкоцитами крови, активированными в процессе контакта с ВПГ-1-инфицированным эндотелием.

В ходе дополнительных экспериментов было установлено, что фиксирован­ные глутаровым альдегидом ВПГ-1-инфицированные ЭК не являются источником жизнеспособного (способного инфицировать другие клетки) вируса. Это позволило исключить влияние собственно вирусной инфекции на продукцию цитокинов клетками крови, контактирующими с инфицированным эндотелием.

Спонтанная продукция интерферонов и цитокинов лейкоцитами крови была минимальна, иногда ниже порога чувствительности использованного метода

определения. Однако, в результате контакта с ЭК, инфицированными ВПГ-1 при различных титрах, лейкоциты активировались и характеризовались высокой секреторной активностью. Результаты одного из серии репрезентативных экспериментов представлены на рисунке

ИФН-7

ИЛ-1

fen ЇЙ t']

0-е 8-Х 24-*8

ИНТЕРВАЛ ВРЕМЕНИ, м

МНОЖЕСТВЕННОСТЬ РН4ЩИР0ВДНИЯ ■о і. ЕЭ° o’- EZ3 «и. do

Рисунок 58.

Продукция интерферонов и цитокинов лейкоцитами периферической крови, активированными в контакте с ВПГ-1-инфицированным и фиксированным глутаральдегидом эндотелием человека.

7.7. Влияние кондиционированных сред, полученных от лейкоцитов,

активированных в результате контакта с инфицированным/фиксированным эндотелием на репродукцию вируса в ЭК.

Как и в случае определения активности кондиционированных сред, полученных от ГМК, тестирование проводилось с использованием относительно низких множественностей инфицирующего вируса - от 0.05 до 0.0005. В результате проведенных экспериментов было установлено, что КС, полученные от лейкоцитов, активированных в результате контакта с ВПГ-1-инфицированными и фиксированными глутаровым альдегидом ЭК, обладают способностью ингибировать репродукцию вируса в контрольных инфицированных клеточных культурах. Результаты, полученные в ходе одного из репрезентативных экспериментов, представлены на рисунке 59.

М/И:—•—1.0; —•—0.1

—*—0.01; —*—0.001 —°— 0.0001; —«— контроль