Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга.
Эксперимент выполнен на базе лаборатории стромальной регуляции иммунитета института эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи (зав. лабораторией Чайлахян Рубен Карпович)
В эксперименте использовались крысы породы «Вистар».
Крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой. Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл при минимальном давлении в нем до получения гомогенной взвеси клеток. Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4°С (400g), осадокресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр.
Для получения штаммов стромальных клеток-предшественников клетки костного мозга эксплантировали во флаконы.
Рисунок 2. Шестилуночный культуральный флакон с питательной средой
На 10-14 день культивирования, когда колонии стромальных фибробластов были полностью сформированы, проводили I пассаж.
Рисунок 3. Первичные культуры клеток
Первичные культуры, выращенные во флаконах, дважды отмывали от сыворотки физиологическим раствором. Затем во флаконы добавляли 2-3 мл. 0,25% раствора трипсина, которым обрабатывали культуры в течение 3-5 мин.,
затем флаконы переворачивали и в таком виде помещали в термостат при 37°С. Через 15-20 минут трипсин сливали, в культуральные флаконы добавляли свежую питательную среду и несколько раз встряхивали их. Не открепившиеся клетки снимали пипетированием. Необходимое количество клеток переносили во флаконы с большей площадью дна. Повторные пассажи проводили по этой же методике по достижении полного монослоя клеток в культурах.
Для изучения взаимодействия штаммов остеогенных клеток- предшественников с остеопластическим материалом, его засеивали пассивированными клетками. Культивирование проводили в течение 5-7 дней. Затем производили фиксацию.
Перед фиксацией культуральную среду сливали, материал несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин. заливали 80% этанолом. Фиксированные культуры окрашивали по Гимзе. После этого оценивали полученный результат под микроскопом.(Воложин А.И. 1998, Фриденштейн А.Я. 1971; Фриденштейн А.Я. 1973)