Анализ пролиферативной активности клеток

3.1. Кривые роста

Для получения кривых роста клетки высевали в ячейки 24-камерных культуральных планшетов и культивировали в стандартной среде. В зависимости от задач конкретных экспериментов плотность посадки варьировала от 10¹ до 10³ клеток/см² (указано в пояснениях к соответствующим разделам в главе "Результаты").

В части экспериментов на прикрепленных к субстрату клетках использовали метод компьютеризированной видео-микроскопии (использовался микроскоп Diaphot-TMD, Nikon, оборудованный цифровой видеокамерой Mintron OS-75D; изображение передавалось на компьютер через видеокарту с отдельным входом). В этом случае просчет числа клеток проводили на распечатках нескольких случайно выбранных полей зрения микроскопа. Следует заметить, что данный способ является более удобным, поскольку ошибка при подсчете клеток значительно ниже (в среднем +2-5 %), чем при использовании для просчетов клеточной суспензии с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.

3.2. Оценка синтеза ДНК по включению меченого предшественника

Клеточные культуры, растущие в ячейках 24- или 48-ячеечных планшетов,

инкубировали в присутствии [³Н]-тимидина (0.1 мкКи/мл) в течение 18 часов. Затем, клетки переносили на лед и обрабатывали согласно Gimbrone et al. [1974]: трижды отмывали от невключившейся метки раствором Эрла, фиксировали смесью 96° этанол-уксусная кислота (3:1) в течение 15 минут, экстрагировали 10 % ТХУ (20 минут), споласкивали 5 % ТХУ и 96° этанолом, после чего лизировали 0.5 М раствором едкого натра. Полученные лизаты переносили в сцинтилляционные флаконы и присчитывали в толуольном сцинтилляторе (толуол - 70 %, абсолютный этанол - 30 %, РРО - 5 г/л, РОРОР - 0,1 г/л) на наличие бета-радиоактивности на счетчике Rack Beta (LKB). Для получения статистически значимых результатов каждую группу просчитывали не менее чем в трех повторах.

id

3.3. Авторадиография

Через 18 часов инкубации в присутствии 1 мкКи/мл (³Н]-тимидина клеточные культуры отмывали раствором Эрла и фиксировали 10 минут в 2.5 % растворе глутарового альдегида на 0.1 М натрий-фосфатном или натрий-какодилатном буфере pH 7.2-7.4. После серии отмывок буфером и дистиллированной водой культуры обезвоживали 96° этанолом и высушивали. Полученные препараты покрывали фотографической эмульсией для авторадиографии (Ilford, К2) и экспонировали в течение 5-7 суток при +4°С. Обработку автографов проводили в соответствии с прилагаемой инструкцией проявителем Kodak D19. После докрашивания ядер гематоксилином Майера просчитывали тимидиновый индекс (% клеток, содержащих меченые ядра). В зависимости от плотности культур анализировали от 100-200 до 1000 клеток в нескольких полях зрения микроскопа.

4.