Определение содержания адипокинов.

Адипонектин. Содержание адипонектина определяли методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови с использованием тест-системы «BioVendor Human Adiponectin ELISA» (Чехия). Стандарты, контроли и исследуемые образцы инкубировали в лунках микропланшета, покрытых поликлональными антителами к адипонектину человека.

Лептин. Метод определения лептина основан на иммуноферментном анализе с использованием тест-системы «BioVendor» (Чехия). В наборе использованы высокоспецифичные моноклональные антитела специфичные к лептину. 1-е антитела иммобилизованы в лунках микроплашета, 2-е конъюгированы с биотином. Во время первого этапа лептин, присутствующий в исследуемых образцах и стандартах, связывался с иммобилизованными антителами и биотинилированными антителами, образуя сэндвич-комплекс. Избыток и несвязавшиеся биотинилированные антитела удаляли на этапе промывки. На втором этапе вносили конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена, который специфически связывался с биотинилированными антителами, а несвязавшийся конъюгат удаляли при промывке. После этого вносили субстрат, который в результате ферментативной реакции образовывал продукт голубого цвета, при этом окраска была прямо пропорциональна количеству присутствующего лептина.

Растворимый рецептор к лептину. Проводили с использованием тест- системы «BioVendor» (Чехия). Во время первого этапа рецепторы лептина, присутствующие в исследуемых образцах и стандартах, связывались с иммобилизованными антителами и биотинилированными антителами, образуя сэндвич-комплекс. Избыток и несвязавшиеся биотинилированные антитела удаляли на этапе промывки. На втором этапе вносили конъюгат стрептавидин- пероксидаза хрена, который специфически связывался с биотинилированными антителами, а несвязавшийся конъюгат удаляли при промывке. После этого вносили субстрат ТМБ, который в результате ферментативной реакции образовывал продукт голубого цвета, при этом окраска была прямо пропорциональна количеству присутствующего рецептора лептина. Ферментативную реакцию останавливали добавлением стоп-реагента, в результате голубая окраска превращалась в желтую. Абсорбция при 450 нм измерялась с помощью микропланшетного спектрофотометра. Для построения калибровочной кривой использовался набор стандартов. Концентрация рецептора лептина в исследуемых образцах была рассчитана непосредственно по калибровочной кривой.

Резистин. Проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «BioVendor» (Чехия). В процессе анализа стандарты и исследуемые образцы инкубировались в лунках микропланшета, покрытых козьими поликлональными антителами к резистину человека. После одночасовой инкубации и тщательной промывки в лунки с иммобилизованным комплексом антитела-резистин добавляли биотинилированные поликлональные антитела к резистину человека. После второй инкубации и процедуры промывки в лунки вносили конъюгат стрептавидина с ферментом пероксидазой хрена.

Ретинол-связывающий белок. Оценку РСБ проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «Immundiagnostik» (Германия). В процессе анализа стандарты и исследуемые образцы инкубировались в лунках микропланшета, покрытых мышиными поликлональными антителами к РСБ человека. После одночасовой инкубации и тщательной промывки в лунки с иммобилизованным комплексом антитела-РСБ добавляли биотинилированные поликлональные антитела к РСБ человека. После второй инкубации и промывки в лунки вносили конъюгат стрептавидина с ферментом пероксидазой хрена, затем вводили субстрат ТМБ, развивалась синяя окраска в результате взаимодействия ТМБ и пероксидазы хрена, реакция останавливалась добавлением раствора кислоты, абсорбция получившегося желтого раствора определялась спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Концентрация РСБ в исследуемых образцах и контролях определялась непосредственно по калибровочной кривой.