а. Определение содержания АТФ в крови.
К 1 мг порошка (1 мл крови или плазмы) приливали 4 мл 0,6 Н перхлорной кислоты, готовили гомогенат и оставляли на 10 мин при 25оС. Затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин.
К 0.2 мл полученного супернатанта приливали 2 мл раствора, содержащего 0,5 М триэтаноламинового буфера pH 7.6, 4 мМ MgSO4 0,6 мМ глицерат-3-фосфат. К данному раствору приливали 0,2 2,5 мМ раствор НАДН. Полученный раствор перемешивали и определяли начальную абсорбцию Е1 при 340 нм на спектрофотометре Cary-118. Затем к данному раствору приливали 0,02 мл суспензии ферментов (глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа - 450 ед/мл; глицеролдегидрогеназа - 1000ед/мл). Перемешивали и выдерживали при 25оС и через 10 минут определяли конечную абсорбцию Е2 при 340 нм. Расчет количества АТФ проводили по формуле: САТФ = 4 556 х (Е1 - Е2), ммоль/л.2.1.2.13. b. Определение АДФ и АМФ.
2,5 мл крови (5 мг порошка) растворяли в 5 мл 1 Н перхлорной кислоты. К 1 мл супернатанта добавляли 0,5 мл триэтаноламинного буфера. Смесь хорошо перемешивали и оставляли 10 мин на водяной бане, затем нагревали до 25оС . Последовательно к 2 мл приливали 0,2 мл раствора, содержащего 10мМ фосфоенолпируват, 1,3 М KCl, 0,4 М MgSO4 , 0,2 мл 2,5 мМ НАДН , 0,02 мл суспензии ЛДГ (~500 ед/мл). Смесь перемешивали и измеряли начальную Е1 абсорбцию при длине волны 340 нм. Затем добавляли 0,02 мл суспензии пируваткиназы (~100ед/мл). После 5 мин измеряли абсорбцию - Е2. Затем добавляли 0,02 мл суспензии миокиназы (~720ед/мл) и через 15 мин измеряли абсорбцию Е3.
Расчет количества АДФ и АМФ проводили по формулам: САДФ = 429 х (Е1 - Е2), мкмоль/л, САМФ = 216 х (Е2- Е3), мкмоль/л.
2.1.2.14.
Еще по теме а. Определение содержания АТФ в крови.:
- Методика определения содержания ацилгидроперекисей липидов в сыворотке крови
- Определение экспрессии растворимой сосудисто-клеточной адгезивной молекулы типа 1 - sVCAM-І в сыворотке крови Определени
- Определение уровня внутриклеточных цитокинов в клетках крови. Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК)
- Определение содержания адениловых нуклеотидов
- Нарушение содержания углеводов в крови
- Изменение метаболизма в надпочечниках и содержания в крови катехоламинов
- Определение содержания НАД^Н.
- Определение содержания пирувата.
- Содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови
- Определение содержания эндотелина-1.
- Методы исследования содержания гормонов сыворотки крови
- Определение содержания глутатиона.
- Содержание VEGF в сыворотке крови в основных группах.