2.1. Эмбриогенез и дифференцировка органов репродуктивно-половой системы

Прежде чем коснуться аспектов эмбриогенеза, следует напомнить некоторые постулаты и принципы функционирования генетического аппарата человека (см. цв. вкл., рис. 2.1 – 2.3).

Первый уровень построения генома предполагает организацию ДНК с гистоновыми белками – образование нуклеосом.

На следующем уровне нуклеосомы укладываются в фибриллу (соленоид). Каждый виток составляет 6 – 7 нуклеосом, при этом линейные размеры ДНК уменьшаются до 1 мм, то есть в 25 – 30 раз.

Третий уровень компактизации – петельная укладка фибрилл – образование петельных доменов, которые под углом отходят от основной оси хромосомы. Их можно увидеть в световой микроскоп как интерфазные хромосомы типа «ламповых щеток». Поперечная исчерченность, характерная для митотических хромосом, отражает в какой-то степени порядок расположения генов в молекуле ДНК.

Если у прокариот линейные размеры гена согласуются с размерами структурного белка, то у эукариот размеры ДНК намного превосходят суммарные размеры значимых генов. Это объясняется мозаичным (экзон-интронным) строением гена, когда экзоны – фрагменты, подлежащие транскрипции, – чередуются с интронами – незначащими участками (рис. 2.5, см. цв. вкл., рис. 2.6, 2.7).

Рис. 2.5. Гаплоидный набор хромосом у мужчины

Последовательность генов сначала полностью транскрибируется синтезирующейся молекулой РНК, из которой затем вырезаются интроны. Экзоны сшиваются, и в таком виде информация с молекулы иРНК считывается на рибосоме.

Развитие половых желез в эмбриогенезе (Балаболкин М. И., 2002) обусловлено набором половых хромосом, образующихся после оплодотворения яйцеклетки. Кариотип 46XX определяет развитие яичников, а 46XY – яичек.

Мужские и женские гонады развиваются из трех различных компонентов: целомического эпителия, мезенхимы и примордиальных герминальных клеток. Первичная половая дифференцировка – это процесс развития половых гонад, который начинается на 6 – 7-й неделе эмбрионального развития. Почки, надпочечники и половые железы развиваются в тесном взаимодействии, имеют общее происхождение и являются производными одной и той же области примитивной мезодермы. Под влиянием факторов транскрипции, в частности фактора WT1 (туморосупрессор опухоли Вилмса), клетки мезодермы трансформируются в почечный примордиум и адреногенитальный примордиум. Последний под влиянием двух факторов транскрипции – SF1 (ген стероидогенного фактора 1, СФ1) и DAX1 – в последующем развивается в кору надпочечника и первичную гонаду. Для развития и функционирования как коры надпочечников, так и первичной гонады требуется нормальная экспрессия SF1. Принято считать, что его действие заключается не в инициации, а в поддержании развития и образования первичной гонады и ранней фазы развития репродуктивного тракта. Следует отметить, что за развитие коры надпочечников отвечает фактор транскрипции DAX1.

Ген SF1 у человека локализуется на хромосоме 9q33 и содержит семь экзонов, включая два некодирующих. SF1 является ядерно-рецепторным фактором транскрипции и регулирует экспрессию многих генов, в том числе генов, кодирующих стероидогенез кортикостероидов. Исключительная важность SF1 в эмбриогенезе гонад подтверждается работой J. C. Acherman (1999), в которой доказано, что мутация гена SF1 сопровождается нарушением половой дифференцировки.

Кроме SF1, первичная роль в развитии примордиальной гонады бипотенциальных протоков принадлежит опухольсупрессорному фактору Вилмса (WT1 или ВО1). Локус гена WT1 у человека локализуется на хромосоме 11p13 и фактически состоит из двух генов – WT1 и WIT1. Экспрессия этого гена у эмбриона человека выявляется начиная с 28-го дня беременности в тканях производных мезодермы – почках, гонаде (клетки Сертоли), мезотелии, а также в спинном и головном мозге. Мутации гена WT1 идентифицированы у больных с Дэнис – Дрэш синдромом (DDS). Указанный синдром характеризуется триадой:

1) гонадальный дисгенез с нарушенной маскулинизацией у эмбриона мужского пола;

2) нефропатия;

3) предрасположенность к опухоли Вилмса.

Как показали исследования S. Barbaux (1997), при синдроме Фрайзера (FS) также имеется мутация гена WT1. Клиническая картина синдрома Фрайзера незначительно отличается от триады Дэнис – Дрэш синдрома и включает:

1) гонадальный дисгенез;

2) нарушенную маскулинизацию плода мужского пола;

3) прогрессивную гломерулопатию;

4) гонадобластому.

Описан также синдром, по клинической картине близкий синдрому Фрайзера, при котором имеет место гонадальный дисгенез.

Таким образом, на самых ранних стадиях развития примордиальной гонады и бипотенциальных протоков большое значение имеют гены SF1 и WT1, а для развития бипотенциальных протоков еще и ген Wnt4. Зародыш гонад (примордиальная гонада) бипотенциален и состоит из двух частей: кортикальной и медуллярной. При двух функционально нормальных Х-хромосомах кортикальная часть индифферентной гонады развивается в яичник. Гены, расположенные в перицентромерной области Y-хромосомы, определяют развитие медуллярной части в яичко. Однако процесс половой дифференцировки более специфичен и помимо указанных хромосом контролируется дополнительно несколькими генами.

Длительное время считалось, что гены, определяющие развитие бипотенциальной гонады в яичко, идентичны генам, которые кодируют H-Y-антиген, являющийся клеточно-поверхностным белком. Он способен оказывать непосредственное действие на дифференцировку первичной гонады в яичко. Однако тщательный анализ больных с различными нарушениями половой дифференцировки показал, что H-Y-антиген не идентичен Y-гену, контролирующему дифференцировку яичка. Еще W. K. Silvers установил, что H-Y-антиген локализуется на длинном плече Y-хромосомы и достаточно далеко от гена, определяющего развитие пола эмбриона. При детальном изучении карты хромосом у лиц с набором 46ХХ-половых хромосом при наличии яичек и мужского фенотипа установлено, что у них имеются участки последовательности Y-хромосомы на Х-хромосоме. На основании этого было высказано предположение, что на Y-хромосоме имеется участок последовательности, названный фактором, определяющим развитие яичка, который локализовался у этих больных в псевдоаутосомальной области. Ген, ответственный за развитие яичка, был идентифицирован D. C. Page [et al.] (1987), а клонированный ими участок хромосомы был назван ZFY. Указанная последовательность (ген ZFY) выявлялась у 46ХХ-фенотипичных мужчин, но отсутствовала у 46XY-фенотипичных женщин. Проведенные исследования позволяют считать, что ZFY является небольшой частью Y-хромосомы, отвечающей за дифференцировку плода. Однако у некоторых больных ZFY обнаруживали на аутосомах. Исследователи описали четырех мужчин с 46ХХ-набором половых хромосом, у которых наследуемый участок Y-хромосомы не включал ZFY (Palmer M. S. [et al.], 1990). Было установлено, что ZFY не является фактором, ответственным за развитие яичка. Почти одновременно другие ученые опубликовали уточняющие данные о локализации гена в области рY 53.3, ответственного за пол эмбриона, назвав его SRY (Sinclair A. H. [et al.], 1990).

Тем не менее SRY участвует в процессах половой дифференцировки в тесном взаимодействии с геном Z (McElreavey K. [et al.], 1993). Его функция в норме заключается в угнетении специфических мужских генов. В случае нормального мужского генотипа 46XY ген SRY продуцирует белок, угнетающий ген Z, и специфические мужские гены активируются. При нормальном женском генотипе 46ХХ и отсутствии SRY ген Z активируется и угнетает специфический мужской ген, что создает условия для развития по женскому типу. У 46ХY-мужчин с мутацией гена SRY, что сопровождается активацией гена Z с угнетением специфического мужского гена, происходит развитие по женскому типу. У 46ХХ-женщин при отсутствии у них SRY должна быть мутация гена Z, сопровождающаяся невозможностью его экспрессии, что способствует осуществлению дифференцировки по мужскому типу. Эта гипотеза объясняет генез развития женского фенотипа при 46XY. У этих лиц имеется интактный ген SRY и, вероятно, мутация гена Z.

Ген SRY локализуется на коротком плече 6-й хромосомы (центромерно к псевдоаутосомальной области Yp 11.3), а продукт этого гена комплексуется с различными участками ДНК. Ген SRY выполняет основную роль в половой дифференцировке и способен вызвать развитие обратного пола. Он экспрессируется в половой полоске только в определенное время эмбрионального развития, когда происходит образование тестикулярных зачатков. Мутация и делеция этого гена имеется у XY-мужчин.

Кроме того, ген SRY на уровне ДНК непосредственно регулирует активность других факторов транскрипции промоторной области гена ароматазы Р450, конвертирующей тестостерон в эстрадиол с угнетением этого процесса у эмбрионов мужского пола, а также ген антимюллерова гормона, ответственного за регрессию протоков Мюллера.

Несмотря на то что ген SRY принимает активное облигатное участие в превращении бипотенциальной гонады в яички, имеются данные, свидетельствующие о том, что одного указанного гена недостаточно для развития яичек (Ramos E. S. [et al.], 1996; Teebi A. S. [et al.], 1998). Имеются дополнительные области на Х-хромосоме и на аутосомах, участвующие в процессах трансформации первичной гонады в яичко. Помимо гена SRY, в указанных процессах половой дифференцировки мужской гонады важная роль принадлежит гену SOX9. К группе SOX-генов (SOX – гены, комплексирующиеся с областью SRY HMG) относят несколько генов (SOX1, SOX2, SOX3 и др.), участвующих в процессах половой дифференцировки первичной гонады. У человека ген SOX9 локализуется на хромосоме 17q 24 – 25 на участке, названном участком аутосомного изменения пола (SRA1), и кодирует фактор транскрипции, играющий важную роль в развитии яичка, в частности, отвечает за дифференцировку клеток Сертоли (Morais da Silva [et al.], 1996). Экспрессия гена SOX9 определяется в яичках в области семявыносящих канальцев на 18-й неделе эмбрионального развития вслед за экспрессией гена SRY. Исследования последних лет позволяют считать, что ген SRY активирует экспрессию гена SOX9, который прямо или опосредованно участвует в развитии клеток Сертоли, тогда как ген DAX1 репрессирует SOX9, угнетая развитие клеток Сертоли и являясь непременным условием трансформации первичной гонады в яичники.

Сравнительно недавно доказано участие гена Dhh и белка этого гена в процессах взаимодействия клеток Сертоли с герминальными клетками (Bitgood M. J. [et al.], 1996). Экспрессию гена Dhh выявляют в предшественниках клеток Сертоли вскоре после активирования гена SRY, и она продолжается во взрослом состоянии. Белок гена Dhh регулирует стадию митоза и мейоза в мужских герминальных клетках. Так, в период эмбриогенеза он контролирует пролиферацию герминальных клеток, а во взрослом состоянии – их созревание.

Об участии Х-хромосомы в дифференцировке первичной гонады свидетельствуют клинические данные не только об ингибировании развития яичек в выявлении Х-связанных рецессивных форм XY-гонадального дисгенеза, но и при удвоении так называемой DSS-области, локализованной на Х-хромосоме. Этот DSS-локус (дозочувствительный локус, ответственный за пол) локализуется в области 160 kb хромосомы (160 kilobase, или 160 тысяч пар нуклеотидов) Хp21 (Bardoni B. [et al.], 1994). При удвоении этого локуса наблюдают регресс яичек даже при наличии интактного гена SRY. Делеция этой области не влияет на образование яичка. Данные исследователей позволяют считать, что DSS-область не воздействует на состояние гена, ответственного за пол. Следует отметить, что A. Ion [et al.] (1996) идентифицировали у больного талассемией еще один сцепленный с Х-хромосомой ген – ХН2. Он участвовал в развитии яичек, мутация которых была выявлена у наблюдаемого ими пациента.

Установлено, что на хромосомах 2q (Slavotinek A. [et al.], 1999); 9p (Veitia R. [et al.], 1997), 10q (Wilkie A. O. [et al.], 1993) и 17q локализуются аутосомные гены, вовлеченные в развитие тестикул. Аутосомальные факторы ответственны за агонадию или синдром рудиментарных яичек, аплазию герминальных клеток и за развитие стрековых гонад у генетических женщин (Hiort O., Holterhus P., 2000).

Из перечисленных выше хромосом особое значение в процессах развития яичка принадлежит хромосоме 9р, на дистальном коротком плече которой локализуются области, участвующие в функции гена, ответственного за пол. Делеция этой области выявлена у больных с 46XY-гонадальным дисгенезом и обратным полом. У одного из таких пациентов заболевание сочеталось с гонадобластомой (McDonald M. T. [et al.], 1997). В последующем в области хромосомы 9р24.3 была идентифицирована локализация двух генов, участвующих в процессах становления пола (Raymond C. S. [et al.], 1999). Эти гены получили название DMRT1 и DMRT2. Окончательная роль и значение указанных генов в процессах половой дифференцировки устанавливаются, однако показано, что ген DMRT1 экспрессируется только в яичках взрослого человека.

В норме уже к 8-й неделе эмбрионального развития яички способны секретировать половые гормоны, которые и определяют соответствующее развитие наружных половых органов. Дифференцировка наружных половых органов по мужскому типу происходит под влиянием тестостерона, который секретируется клетками Лейдига эмбриона. Последние образуются из интерстиция уже на 9-й неделе эмбрионального периода. Несколько позже эти клетки продуцируют тестостерон, уровень которого достигает максимального значения к 15 – 18-й неделе (Wilson J. D. [et al.], 1995). Уже к середине беременности содержание тестостерона в амниотической жидкости достоверно выше у плодов мужского пола, чем женского. Скорость и количество секретируемого тестостерона определяется активностью 3â-гидроксистероидной дегидрогеназы, которая в тестикулах эмбриона мужского пола в 50 раз выше чем в эмбрионе женского пола. Считается, что в течение первого триместра беременности до начала секреции ЛГ передней долей гипофиза плода образование тестостерона клетками Лейдига может находиться под контролем хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), который вырабатывается плацентой. Активаторами тестостерона в тестикулах являются ИФР1 и ингибин, а ингибиторами – α-трансформирующий фактор роста (α-TGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), активин, ИЛ1, кортиколиберин, вазопрессин, ангиотензин II. Ферменты, участвующие в биосинтезе андрогенов, приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1

Ферменты, участвующие в биосинтезе андрогенов

В клетках-мишенях (урогенитальный синус) должно быть достаточное количество рецепторов к тестостерону, наличием которых и объясняется чувствительность тканей к этому гормону. Гены, контролирующие синтез рецепторов к андрогенам, локализуются на Xq11-12-хромосоме. Ученые установили, что наличие у больных резистентности к андрогенам различной степени выраженности связано с мутациями гена рецептора к андрогенам (Lumbroso S. [et al.], 1992). Рецепторы к андрогенам, как и другие рецепторы к стероидным и тироидным гормонам, состоят из гормонсвязывающего домена, ДНК-связывающего домена и N-концевого домена. Большинство мутаций при андрогенрезистентных состояниях выявлены в гормонсвязывающем домене.

Следует отметить, что в клетках-мишенях (урогенитальный синус и наружные половые органы) дифференцировку урогенитального синуса в наружные половые органы по мужскому типу опосредует не сам тестостерон, а его производная – 5α-дигидротестостерон, который обладает большей биологической активностью. В цитозоле клеток-мишеней содержится фермент 5α-редуктаза (ген 5α-редуктазы расположен на 2-й хромосоме 2р13), конвертирующий тестостерон в дигидротестостерон (ДГТ), который является «чистым» андрогеном и не подвергается воздействию ароматазы и поэтому не может быть конвертирован в эстрогены. Ген 5α-редуктазы экспрессируется в период половой дифференцировки в тканях предстательной железы, урогенитального синуса и наружных половых органов. Выявляют две изоформы 5α-редуктазы. 5α-редуктаза типа 1 (экспрессируется в эпителиальных клетках и проявляет максимальную активность при рН 8,0) и 5α-редуктаза типа 2 (экспрессируется в мезенхимальных андрогенчувствительных и андрогеннечувствительных клетках и проявляет активность при рН 5,5). ДГТ комплексируется с высокоаффинным рецептором цитоплазмы, после чего гормонорецепторный комплекс перемещается в ядро и взаимодействует с местами связывания на хроматине ДНК, что активизирует определенные гены и стимулирует синтез белков. Цитозольный рецептор, связывающий андрогены, регулируется геном, расположенным на Х-хромосоме.

Наряду с тестостероном, большое значение в дифференцировке половых признаков имеет гормон, угнетающий развитие парамезонефрического протока (проток Мюллера), который секретируется клетками Сертоли эмбриона и под влиянием которого происходит инволюция протоков Мюллера, то есть ингибируется их дифференцировка в матку и маточные трубы. Антимюллеров гормон (АМГ) относится к семейству β-трансформирующего фактора роста, к которому также принадлежат активин, ингибин и другие факторы, участвующие в дифференцировке и росте клеток. У человека ген АМГ локализуется на 19-й хромосоме, и его секреция клетками Сертоли осуществляется от периода тестикулярной дифференцировки до пубертата. Примордиальные герминальные клетки являются предшественниками сперматогоний в яичке и овоцитов в яичнике. Дифференцировка бипотенциальной гонады в яичко начинается с процесса миграции примордиальных герминальных клеток на 7-й неделе развития (43 – 50-й день эмбрионального развития, когда длина плода составляет всего 13 – 20 мм). Происходит трансформация интерстициальных поддерживающих клеток в клетки Сертоли, которые затем агрегируют (начинают соединяться друг с другом) и образуют семявыносящие канальцы. Для дифференцировки первичной гонады в яичко необходима также нормальная функция клеток Сертоли, секретирующих антимюллеров гормон, который комплексируется с соответствующими рецепторами. Ген, кодирующий синтез рецепторов к АМГ, локализуется на 12-й хромосоме. При нормальном взаимодействии АМГ с его рецептором и последующих пострецепторных воздействиях у эмбриона мужского пола ингибируется развитие протоков Мюллера, и они подвергаются обратному развитию. Клетки Лейдига дифференцируются из мезенхимы уже на 9-й неделе внутриутробного развития и способны секретировать тестостерон, содержание которого предельно возрастает на 15 – 18-й неделе. Эти клетки имеют рецепторы, связывающие как ЛГ, так и хорионический гонадотропин, под влиянием которого осуществляется биосинтез тестостерона. Секреция тестостерона в период эмбрионального развития имеет прямую корреляцию с уровнем ХГЧ. Лишь позже гипофиз плода начинает секретировать ЛГ, обеспечивая вместе с ХГЧ нормальную секрецию тестостерона, дифференцировку урогенитального синуса, рост и развитие наружных мужских половых органов.

Таким образом, для нормального мужского фенотипа (рис. 2.8) необходимы интактная Y-хромосома с локализацией на ней генов SRY и SOX9, а также нормальная функция Х-хромосомы с наличием на ней гена, ответственного за рецепторы к андрогенам. Для последующей дифференцировки организма по мужскому типу необходимо не только нормальное образование клеток Лейдига и Сертоли (адекватная экспрессия SF1), но и секреция тестостерона – гормона, угнетающего развитие протока Мюллера. Кроме того, необходимо наличие в клетках-мишенях 5α-редуктазы, цитозольных рецепторов к андрогенам в протоках Вольфа, урогенитальном синусе и наружных половых органах, мембранных рецепторов, связывающих фактор, угнетающий развитие протока Мюллера, и, естественно, интактного андрогенрегулируемого гена транскрипции белков. Дефект в любом звене этого механизма приведет к нарушению половой дифференцировки и развитию организма по женскому типу. Необходимо отметить, что под влиянием АМГ к 10-й неделе происходит дегенерация мюллеровых протоков, а к 14-й из вольфовых протоков под контролем тестостерона формируются придатки яичек, семявыносящие протоки и семенные пузырьки (Шабалов Н. П., 2003).

Рис. 2.8. Влияние генетических и гормональных факторов на дифференцировку яичек и формирование мужского фенотипа

Наружные половые органы формируются на 12 – 14-й неделе внутриутробного развития вместе с уретрой и дистальными отделами кишечника. Под влиянием ДГТ, образующегося из тестостерона в клетках полового бугорка и губно-мошоночных складок в присутствии фермента 5α-редуктазы, формируется губчатая часть мочеиспускательного канала и мошонка. Формирование полового члена и мошонки заканчивается к 16 – 17-й неделе гестации.

После 20-й недели происходит миграция яичек из забрюшинной области в мошонку, причем первый этап – опускание яичек до уровня внутреннего пахового кольца – контролирует АМГ, а второй этап – опускание яичек через паховый канал в мошонку – тестостерон. Миграция яичек завершается в основном к 35 – 36-й неделе, а к 38 – 40-й неделе у большинства новорожденных окончательно формируется паховый канал и прерывается сообщение между брюшной полостью и мошонкой.

Обобщенные данные по генетическому контролю над дифференцировкой пола представлены в табл. 2.2.

Таблица 2.2

Обобщенные данные по основным участкам генома, контролирующим дифференцировку мужского пола