Количественные аспекты.

Взаимоотношения между метабо­литами и антиметаболитами обычно имеют конкурентный ха­рактер, т. е. если х молекулам метаболита противодействует у молекул аналога, то для достижения того же биологического эффекта 10х молекулам метаболита потребуется 10у молекул аналога.

Для каждой пары веществ существует свой специфический индекс ингибирования, определяемый как соотношение числа молекул аналога к числу молекул метаболита, при кото­ром достигается 50% ингибирование. Это соотношение имеет разные значения для различных биологических видов, но она всегда одинаково для каждого данного вида. Оно характеризует относительное сродство аналога и метаболита к рецептору и, кроме того, отражает различия в способности двух веществ проникать к месту действия, особенно тогда, когда это место труднодоступно. Поэтому уровень ингибирования, вызванного аналогом, определяется двумя факторами: во-первых, относи­тельным сродством аналога и метаболита к рецептору и, во-вто­рых, относительными количествами аналога и метаболита в месте реакции.

Соодство субстрата к ферменту характеризуется уравнением:

где [Е—концентрация фермента, [S]—кон­центрация субстрата, a [ES]—концентрация комплекса, кото­рый они образуют. Естественно, сродство лекарственного пре­парата, являющегося ингибитором (I) фермента, может быть описано аналогичным выражением и тогда константа ингиби­рования (Ki), т. е. константа диссоциации комплекса фермент — ингибитор будет представлена уравнением:

В отличие от ингибитора субстрат под действием фермента превращается в продукт (Р) и последовательность событий становится:

Соотношение констант скоростей к'/к" есть ничто иное, как константа Михаэлиса — Ментен (К_м).

22

Индекс ингибирования, характерный для каждой пары ингибитор — метаболит, — это соотношение Кі ■ Km — чем ниже его величина, тем эффективнее ингибитор.

Константа Михаэлиса, очевидно, обратно пропорциональна сродству фермента к субстрату и численно равна концентрации субстрата в тот момент, когда скорость реакции достигает по­ловины максимальной. Размерность величин Кі и Кт выража­ется в г-моль/л. Однако это не истинные константы равновесия, а отношения констант скоростей прямой и обратной реакций фермента с субстратом или ингибитором. Наиболее удобно определять Кт графическим методом Lineweaver, Burk (1934), согласно которому строится график зависимости обратной величины начальной скорости образования комплекса [ES] от обратных величин концентрации субстрата. На графике должна получиться прямая линия, при этом точка пересечения получен­ной прямой с осью абсцисс соответствует величине Кт.

Поскольку интенсивные метаболические процессы в клетках гораздо чаще приводят к «стационарному» состоянию, чем к равновесному, целесообразно использовать уравнение Бриггса — Холдейна [Briggs — Haldane, 1925], которые показали, что сов­сем необязательно предполагать наличие равновесия между [Е] и [S]. Они вывели уравнение (V), формально аналогичное уравнению Михаэлиса — Ментен, но предполагающее условия стационарного состояния, а не равновесия.

Константа Кьь, имеющая более общий характер, чем преды­дущая, является показателем степени одновременной диссоциа­ции комплекса [ES], протекающей в двух противоположных на­правлениях. Если Кт заменить на Кьь, то индекс ингибирования становится равным соотношению Кі : Кьи- При проведении этих расчетов предполагается, что ни ингибитор, ни его комплекс с ферментом не разрушаются даже частично под действием дру­гих биологических веществ, которые могут присутствовать при реакции.

Молярный индекс ингибирования малоновой кислоты равен >/з [Thron, 1953]. Еще более эффективно ингибирует оксид угле­рода, когда замещает кислород в гемоглобине (1/210). Величи­ны индекса ингибирования меньше единицы необычны, потому что очень редко аналог обладает большим сродством к природ­ному рецептору, чем нормальный субстрат. Беспрецедентно высокий индекс ингибирования (1/10 000) для метотрексата (4.7) обусловлен, вероятно, тем, что самым основным атомом азота в молекуле этого ингибитора является N-1, в отличие от дигидрофолиевой кислоты, у которой таковым служит N-5. Очевидно, в этом заключена причина столь больших различий в соответствии метотрексата и дегидрофолиевой кислоты месту связывания их с рецептором (разд. 4.2 и 9.3.3). Такие индексы

ингибирования как у метотрексата (1/10 000)—предел обычно наблюдаемых для лекарственных веществ. Индексы ингибиро­вания, величины которых лежат выше единицы, такие как, например, сульфаниламида по отношению к ПАБ (300/1) — другой предел, ниже которого не следует ожидать высокого терапевтического эффекта аналога.

Почему желательны минимальные величины индексов инги­бирования для лекарственных препаратов? Потому что эволю­ция обусловила появление ферментов, использующих соответст­вующие природные субстраты с максимальной эффективностью. Другая причина относительно малой эффективности многих конкурентных ингибиторов — стационарное состояние живой клетки. Атакуемый фермент постоянно снабжается субстратом (от предыдущего фермента в цепи), а его продукт непрерывно удаляется последующим ферментом. Фермент, атакуемый инги­битором, обычно недостаточно насыщен субстратом и поэтому имеет большую резервную активность. При введении конкурент­ного ингибитора в стационарную систему целевой фермент сна­чала ингибируется, но по мере накопления нереагирующего нормального субстрата это ингибирование фермента прекраща­ется. Таким образом, возникает новое стационарное состояние, в котором общий итог действия данного метаболического пути остается неизменным, поскольку концентрация субстрата для атакуемого фермента поддерживается на более высоком уров­не с тем, чтобы уравновесить эффект ингибирования [Cleland, 1970]. В качестве примера можно привести различия между хи­мией модельных систем, изучаемых в лаборатории, и более сложных систем, образовавшихся в живой клетке в процессе эволюции.