Разработка и валидация экспериментальной модели острого шейного лимфаденита

Все эксперименты проводили в соответствии с:

- Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

- Guide for the care and use of laboratory animals 8th edition. Copyright 2011 by the National Academy of Sciences. All rights reserved. - Washington, D.C. 2010.

- Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434­2009«Принципы надлежащей лабораторной практики».

- Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

Эксперименты проводили согласно плану испытаний, который был одобрен биоэтической комиссией ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации».

С целью разработки и валидации фармакологической модели экспериментального острого шейного лимфаденита было протестировано 3

провоспалительных агента, вызывающих воспалительную реакцию в тканях: ЛПС в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин 0,8 мг/кг водный раствор и формалин 8 мг/кг водный раствор. Вещества вводили непосредственно в ткань лимфатического узла Inn. Cervicales superficiales.

В исследовании использовали 80 крыс-самок и 80 крыс-самцов линии Вистар, средней массой к началу исследования 200 г (таблица 7).

Таблица 7

Дизайн исследования по разработке экспериментальной модели острого шейного лимфаденита (выбор провоспалительного агента)

Выбор доз провоспалительных агентов

Выбор доз для ЛПС и каррагенина был обусловлен литературными данными, где для создания большинства экспериментальных моделей ЛПС используется в дозе 100 мкг/кг (Тюренков И.Н., Самотруева Н.Н., 2011; Samotrueva M.A.

Доза водного раствора формалина была определена экспериментальным путем. При введении более высоких доз формалина (16 и 12 мг/кг) наблюдались некротические изменения ткани лимфатических узлов, т.е. поражение было значительно более сильным, нежели острая воспалительная реакция. При использовании более низких доз раствора формалина (6 и 4 мг/кг) у животных либо развивалась недостаточно выраженная картина острого воспаления (6 мг/кг), либо наступало самоизлечение (4 мг/кг).

Индукцию острого лимфаденита проводили путем введения провоспалительных агентов в верхний лимфатический узел справа (Inn. Cervicales superficiales)(рисунок 4).

Рисунок 4 - Расположение шейных лимфатических узлов крысы

(16 - Inn. Cervicales superficiales)

Осуществление доступа к шейным лимфатическим узлам, введение провоспалительных агентов в шейные лимфатические узлы, извлечение лимфатических узлов

Животных наркотизировали «Золетил» + «Ксила».

После наступления устойчивого наркоза животное фиксировали на операционном столике спиной вниз (рисунок 5).

Дезинфицирующим раствором обрабатывали переднюю поверхность шеи животного (рисунок 6).

В области операционного поля срезали шерсть (рисунок 6).

Рисунок 5 - Фиксация животного

Рисунок 6 - Обработка операционного

поля

Выполняли срединный разрез кожи около 2 см (рисунок 7).

Отпрепаровывали фасции тупым способом при помощи анатомического пинцета с узкими браншами, обнажая лимфатические узлы (рисунок 7).

С помощью инсулинового шприца вводили провоспалительный агент в объеме 10 мкл в верхний лимфатический узел справа (рисунок 8).

После операции рану послойно ушивали. Рану обрабатывали антисептиком.

Прооперированное животное помещали в чистую клетку.

После эвтаназии доступ к лимфатическим узлам осуществлялся аналогично (рисунок 6), лимфатические узлы извлекали при помощи хирургических инструментов.

Известно, что наиболее выраженные клинические проявления ангины у людей наблюдаются на 3 сутки заболевания, в связи с этим было принято решение проводить эвтаназию экспериментальных животных через 72 часа от момента введения провоспалительных агентов и через 120 часов, для того чтобы оценить динамику развития воспалительного ответа.

Для оценки экспериментальной модели исследовали следующие показатели:

• содержание С-реактивного белка в плазме крови (см. п. 2.11.);

• определение основных провоспалительных цитокинов TNF-α и INF-γ в сыворотке крови (см. п. 2.11. );

• определение гематологических показателей крови (см. п. 2.12.);

• разницу в массе пораженного и интактного лимфатических узлов;

• процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании (см. п. 2.13);

• морфологический анализ лимфатических узлов (см. п. 2.14.).

Для проверки правильности (точности) и сходимости показателей, характеризующих развитие экспериментальной патологии, было проведено три серии экспериментов. Эксперименты проводились на самках линии Вистар в различные сезоны (весна, лето, осень) (Cook C.D., Nikerson M.D., 2005; Lariviere W.R. et al., 2006) (таблица 8):

Первая серия экспериментов была проведена с 23.03.10 по 26.03.10

Вторая серия экспериментов была проведена с 21.06.10 по 24.06.10

Третья серия экспериментов была проведена с 14.10.10 по 17.10.10

Таблица 8

Дизайн исследования по валидации экспериментальной модели шейного лимфаденита на самках крыс линии Вистар, M±m, n=10