ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные исследования позволили установить эффективность применения новых препаратов природного происхождения КЛС-04 и фрешнос, обладающих выраженными противовоспалительными свойствами на новых разработанных и валидированных экспериментальных моделях заболеваний верхних дыхательных путей - острого шейного лимфаденита и острого риносинусита соответственно.

Разработка эффективных препаратов и схем лечения и профилактики заболеваний верхних дыхательных путей играет одну из ведущих ролей в современной медицине. Дифференцированный подход к установлению фармакологической эффективности и механизмов действия препаратов на доклиническом этапе исследования позволяет прогнозировать состоятельность новых лекарственных средств в клинике и грамотно планировать клинические испытания. Использование новых методов получения лекарственных препаратов и разработка новых лекарственных форм является актуальной задачей современной фармакологии.

Группа заболеваний, имеющих общее название ОРВИ, вызываемых различными нозологичесикми агентами наиболее часто проявляются в виде острого риносинусита и острого тонзиллита. Для лечения этих заболеваний сегодня широко используются антибактериальные препараты и нестероидные противовоспалительные средства. Разработка эффективных природных препаратов, направленных на лечение данной группы заболеваний, остается актуальной, так как лекарственные средства природного происхождения способны оказывать выраженные фармакологические эффекты, при этом не обладают иммуносупрессивным действием. Проведение доклинических исследований таких препаратов осложняется отсутствием валидированных фармакологических моделей.

Исследованный в данной работе препарат КЛС-04, разработанный на основе пептидно-фосфолипидного комплекса печени рыб семейства тресковых, обладает выраженными противовоспалительными свойствами, которые были изучены на экспериментальных моделях адъювантного артирита (Рыбакова А.В., Крышень К.Л., 2012) и контактного дерматита (Крышень К.Л.

Компоненты второго исследованного препарата, фрешнос, обладают известными терапевтическими свойствами. Основными компонентами препарата являются трава тысячелистника обыкновенного, листья шалфея лекарственного и трава зверобоя продырявленного.

В данной работе исследования проводились на крысах линии Вистар как наиболее доступной и широко используемой тест-системе. Были использованы здоровые половозрелые самцы и самки крыс, с массой тела 200±20 г.

Выбор провоспалительных агентов был обусловлен литературными данными о том, что на сегодняшний день существует множество экспериментальных моделей воспалительных заболеваний бронхолегочной системы, индуцируемых такими провоспалительными агентами как ЛПС (Herber- Jonat S. et al., 2011; Patial S. et al., 2011), каррагенин (Rossi A. et al., 2010; Ceccarelli M. et al., 2009; Mochizuki M. et al., 2005; Dugo L. et al., 2004) и формалин (Руководство..., 2012).

Таблица 42

Литературные данные о компонентах препарата фрешнос

ЛПС является основным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий E.coli, обеспечивая структурную целостность бактериальной клетки и защищая мембрану от агрессивных воздействий окружающей среды (Beutler B., Rietschel E.T., 2003; Caroff M., Karibian D., 2003).

Каррагенин получают из красных морских водорослей. Каррагенины, построенные из наиболее часто встречающихся дисахаридных повторяющихся звеньев, принято обозначать греческими буквами. В настоящем исследовании использовался Х-каррагенин, который достаточно хорошо растворяется в воде.

Формалин - водный раствор, содержащий 40% формальдегида, 8% метилового спирта и 52% воды. Попадание формалина на живую ткань слизистых носа и дыхательных путей вызывает повреждение по типу коагуляционного некроза и воспаления прилежащих тканей.

Также выбор провоспалительных агентов был обусловлен отсутствием в их составе инфекционной составляющей, что упрощает работу исследователя и не требует специального оборудования и соблюдения строгого санитарного режима.

Для разработки и валидации острого шейного лимфаденита было протестировано 3 провоспалительных агента, вызывающих воспалительную реакцию в тканях: ЛПС в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин 0,8 мг/кг водный раствор и формалин 8 мг/кг водный раствор.

Для оценки экспериментальной модели исследовали следующие показатели: содержание С-реактивного белка в плазме крови, определение основных провоспалительных цитокинов TNF-α и INF-γ в сыворотке крови, определение гематологических показателей крови, разницу в массе пораженного и интактного лимфатических узлов, процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании, морфологический и морфометрический анализ лимфатических узлов.

В результате было показано, что наиболее выраженные статистически значимые изменения уровня С-реактивного белка были отмечены у самок крыс через 72 часа после введения раствора ЛПС. Повышение данного показателя составило 42% по сравнению с интактными животными. Также через 72 часа от момента индукции патологии, отмечалось статистически значимое увеличение лейкоцитов во всех экспериментальных группах по сравнению с интактными животными. Наиболее выраженные изменения были получены у самок крыс на

фоне введения ЛПС и каррагенина. В лейкоцитарной формуле наблюдался гранулоцитарный сдвиг, что свидетельствует о снижении иммунного ответа. При оценке уровня TNF-α, одного из основных цитокинов, в крови экспериментальных животных было показано, что максимально выраженная картина воспаления наблюдалась на фоне введения в лимфатические узлы раствора ЛПС, увеличение данного показателя составило по сравнению с интакными животными 14 раз для самцов и 15 раз для самок. Уровень IFN-γ также являющегося важнейшим провоспалительным медиатором, подобно TNF-α наиболее значимо увеличивался в группе животных, которым вводили ЛПС. Показатель разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов при введении в качестве провоспалительных агентов ЛПС и каррагенина статистически значимо превышал данный показатель интактных животных через 72 и 120 часов от момента индукции патологии. Наиболее выраженные изменения были отмечены при введении экспериментальным животным раствора ЛПС через 72 часа от момента индукции патологии, повышение данного показателя для самцов составило 3,5, для самок - 4,3 раза.

В результате разработки экспериментальной модели острого шейного лимфаденита:

А. Определен оптимальный провоспалительный агент - ЛПС в дозе 0,1 мг/кг или каррагенин в дозе 0,8 мг/кг.

Б. Выбрана наиболее подходящая тест-система - крысы самки линии Вистар.

В. Сформирован перечень наиболее информативных показателей, характеризующих данную экспериментальную патологию с точки зрения дальнейшей оценки эффективности лекарственных средств:

• Концентрация С-реактивного белка в плазме крови через 72 часа.

• Уровень лейкоцитов в крови через 72 часа.

• Уровень медиаторов воспаления в сыворотке крови: TNF-α через 4 часа и INF-γ через 16 часов.

• Оценка степени отека пораженных лимфатических узлов через 72 часа (разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании).

• Гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и степени гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов.

Разработанная экспериментальная модель была валидирована по показателям правильность (точность) и сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени года по основным показателям экспериментальной патологии: уровень СРБ и лейкоцитов через 72 часа от момента индукции патологии, уровень TNF-α через 4 часа и INF-γ через 16 часов, степень отека пораженных лимфатических узлов через 72 часа (разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании), гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и степень гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов.

Для изучения эффективности нового препарата КЛС-04 был выполнен эксперимент на 100 крысах-самках линии Вистар. Было сформировано 10 экспериментальных групп по 10 животных в каждой группе.

В качестве препаратов сравнения были выбраны зарегистрированные на территории РФ препараты тантум верде, диклофенак и дексаметазон, обладающие выраженным противовоспалительным эффектом.

Для установления эффективной дозы препарата КЛС-04 он был изучен в широком диапазоне доз: 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг.

Путь введения для КЛС-04 и тантум верде - распыление на заднюю стенку глотки, аналогично пути применения в клинической практике. Для диклофенака и дексаметазона были выбраны пути введения, аналогичные клиническому применению - пероральный и внутримышечный, соответственно, при этом были использованы терапевтические дозы данных препаратов в пересчете на массу экспериментальных животных с учетом метаболических коэффициентов.

Исследуемый препарат и препараты сравнения вводили животным один раз в сутки, на протяжении 10-ти дней до индукции лимфаденита и 3 дня после.

Введение препаратов осуществляли с помощью специального шприца и зонда для эндотрахеального введения (IA-1C-M Penn-Century Inc., USA).

При оценке биохимических и гематологических показателей крови было показано снижение уровня TNF-α у экспериментальных животных через 4 часа от момента индукции патологии до значений интактных животных на фоне применения препаратов сравнения диклофенака и дексаметазона, что свидетельствует о наличии у данных препаратов выраженного противовоспалительного эффекта. При использовании препарата сравнения тантум верде наблюдалось снижение данного показателя в 2,3 раза по сравнению с контрольной группой, что также свидетельствует о наличии у данного препарата выраженного противовоспалительного эффекта, однако уровень интактных животных достигнут не был. На фоне применения исследуемого КЛС-04 была отмечена выраженная дозозависимость. В минимальной дозе противовоспалительного эффекта в отношении уровня TNF-α отмечено не было, в

средних дозах снижение данного показателя составило 1,6 и 2 раза для доз 0,8 и 1,6 мг/кг, соответственно. В максимальных дозах КЛС-04 3,2 и 6,4 мг/кг противовоспалительный эффект был выражен максимально и превосходил препарат сравнения тантум верде.

В отношении показателя INF-γ на фоне лечения терапевтический эффект был показан только для препаратов сравнения диклофенак и дексаметазон, где был достигнут уровень интактных животных. Также значительный терапевтический эффект был показан для исследуемого КЛС-04 в максимальных дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, уровень INF-γ был статистически значимо снижен по сравнению с контрольной группой.

Статистически значимый эффект в отношении уровня СРБ наблюдался только на фоне применения КЛС-04 в максимальных дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, снижение уровня СРБ произошло до показателей интактных животных.

Через 72 часа от момента индукции патологии уровень лейкоцитов увеличился в контрольной группе в 2,8 раза по сравнению с интактными животными. На фоне лечения препаратом сравнения тантум верде данный показатель был снижен в 2 раза по сравнению с контролем. Также выраженный терапевтический эффект был показан для препарата сравнения дексаметазон, снижение уровня лейкоцитов произошло до значений интактных животных. При использовании в качестве лечения исследуемого КЛС-04 была показана дозозависимость и максимально выраженный терапевтический эффект, сопоставимый с препаратом сравнения при использовании максимальной дозы 6,4 мг/кг, при этом был достигнут уровень интактных животных.

На фоне лечения во всех экспериментальных группах было показано одинаковое статистически значимое снижение процента потери массы пораженного лимфатического узла по сравнению с контрольной группой (на 28­30%), что свидетельствует о наличии у всех исследуемых препаратов во всех дозах выраженного противоотечного действия, за исключением препарата сравнения дексаметазон для которого не удалось установить противоотечный эффект ввиду высокой смертности экспериментальных животных.

Гистологически установлено, что при экспериментальном моделировании острого шейного лимфаденита в группах крыс без лечения и получавших лечение препаратами КЛС-04 и тантум верде в регионарных лимфатических узлах развивалась картина острого неспецифического лимфаденита, которая характеризовалась изменениями лимфатических узлов с иммунным ответом по гуморальному типу. При этом максимальный положительный эффект наблюдался в группах животных, получавших КЛС-04 в дозах 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг, что проявлялось в основном в ингибировании пролиферации лимфоцитов, но не макрофагов и гистиоцитов.

В ходе данного эксперимента было показано, что наиболее выраженным дозозависимым противовоспалительным действием обладает КЛС-04 в дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, что позволяет рекомендовать его для применения в терапии в качестве противовоспалительного средства.

Исследование биохимических процессов метаболизма жирных кислот в последнее десятилетие привело к открытию новых классов липидных медиаторов, структурно отличающихся от известных ранее простагландинов и лейкотриенов. К ним относятся резолвины, протектины и марезины (Ishizuka T. еt al., 2008; Serhan C. et al., 2011). Предшественники этих медиаторов образуются под действием ЦОГ и ЛОГ из ω-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), включая эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую. Главной биологической ролью этих медиаторов является участие в завершении острой фазы воспаления и переход в стадию разрешения (рисунок 42).

Рисунок 42 - Участие ω-6 и ω-3 ПНЖК в инициации и развитии острого

воспаления (цит. по Крышень К.Л. и соавт., 2013)

Эти медиаторы блокируют инфильтрацию нейтрофилов, привлекают моноциты, нормализуют проницаемость сосудов, вызывают апоптоз остатков нейтрофилов и содействуют их дальнейшиму фагоцитозу, контролируют отток макрофагов через лимфатические сосуды и облегчают удаление экссудата и фибрина из воспаленной ткани, что способствует нормальному гомеостазу (Serhan

C. et al., 2008).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что КЛС-04 приводит к торможению синтеза простагландинов и лейкотриенов из арахидоновой кислоты, и инициирует образование резолвинов, протектинов и марезинов, участвующих в разрешении воспалительного процесса.

С целью разработки фармакологической модели острого риносинусита было протестировано 3 провоспалительных агента, вызывающих воспалительную реакцию в тканях: ЛПС в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин в дозе 1,6 мг/кг и формалин в дозе 12 мг/кг водный раствор.

Провоспалительные агенты вводили непосредственно в носовые ходы крыс путем дозированного закапывания с использованием механических дозаторов с пластиковыми наконечниками.

Через 7 дней животных эвтаназировали.

При введении в носовые ходы провоспалительных агентов в первые же сутки у экспериментальных животных отмечались изменения, характерные для клинической картины острого риносинусита. Наиболее выраженные изменения были отмечены после введения в носовые ходы формалина, которые проявлялись затрудненным дыханием, покраснением слизистой оболочки и кожи вокруг наружных носовых ходов, мокнутием шерсти вокруг носовых ходов, выделениями серозного или гнойного характера из носовых ходов, чиханием.

При изучении экспериментальной патологии оценивали количество бокаловидных клеток слизистой носовых ходов, содержавших кислую слизь.

Количество бокаловидных клеток при введении экспериментальным животным ЛПС и каррагенина увеличилось вдвое по сравнению с интактными животными, а при введении формалина увеличение данного показателя произошло в 2,9 раза для самцов и в 3,3 раза для самок. Схожие данные были получены Jung H.W. et al., 2013 на экспериментальной модели аллергического риносинусита.

Кроме того во всех экспериментальных группах, которым были введены провоспалительные агенты, слизистая оболочка и подслизистый слой имели инфильтрацию клеточными элементами. Наиболее выраженная инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами была отмечена у самок, которым в качестве провоспалительного агента был введен формалин. Аналогичные данные были показаны Yamasaki M. et al. в 2002 году на экспериментальной модели аллергического риносинусита.

Таким образом, в ходе разработки экспериментальной модели острого риносинусита установлено:

А. Определен оптимальный провоспалительный агент - формалин в дозе 12 мг/кг водный раствор.

Б. Выбрана наиболее подходящая тест-система - крысы самки линии Вистар.

В. Сформирован перечень наиболее информативных показателей, характеризующих данную экспериментальную патологию с точки зрения дальнейшей оценки эффективности лекарственных средств:

• Клиническая картина.

• Макроскопические признаки воспаления носовых ходов.

• Количество бокаловидных клеток.

• Инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя

лейкоцитами.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что была получена адекватная экспериментальная модель острого риносинусита у крыс самок линии Вистар, путем развития асептического воспаления носовых ходов.

Данная экспериментальная модель, благодаря своей дешевизне и относительной простоте исполнения, может быть применима для исследований препаратов, нацеленных на лечение острых риносинуситов, а также для оценки противовоспалительного, сосудосуживающего и других эффектов препаратов, применяемых в ЛОР-практике.

Для проверки сходимости показателей, характеризующих развитие экспериментальной патологии, было проведено три серии экспериментов. Эксперименты проводились на самках линии Вистар в различные сезоны (весна, лето, осень) (Cook C.D., Nikerson M.D., 2005; Lariviere W.R. et al., 2006).

По данным микроскопии во всех сериях экспериментов у животных наблюдалась идентичная выраженная лейкоцитарная инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя носовых ходов, что характеризует развитие острого воспаления. Однако критерий микроскопической картины изменений слизистой носовых ходов, затруднительно валидировать, поскольку возможна лишь полуколичественная оценка (баллы) выраженности критерия, поэтому для данного параметра, валидационная оценка не проводилась. Оценить

количественно клиническую картину и макроскопические признаки также не представлялось возможным, поэтому количественная оценка и дисперсионный анализ были проведены по показателю количества бокаловидных клеток и инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя. Дисперсионный анализ по сериям экспериментов не выявил статистически значимых отличий между серями экспериментов. Таким образом, можно утверждать, что фактор времени года не влияет на результаты исследования и новая экспериментальная модель острого риносинусита валидирована по показателю сходимость.

Для изучения эффективности нового растительного препарата фрешнос был выполнен эксперимент на 60 крысах-самках линии Вистар. Было сформировано 6 экспериментальных групп по 10 животных в каждой группе.

Была проведена оценка диапазона доз препарата фрешнос 10, 20 и 30 мкл/100 г массы тела в сравнении с препаратами аквамарис (50 мкл/100 г массы тела) и виброцил (50 мкл/100 г массы тела). Препараты вводили животным путем дозированного закапывания непосредственно в носовые ходы. Лечение экспериментальных животных осуществлялось с первого по седьмой день после введения формалина. На фоне лечения у всех экспериментальных животных наблюдалось снижение интенсивности клинических проявлений острого риносинусита в динамике.

В отношении показателя количества бокаловидных клеток на фоне применения препаратов сравнения аквамарис и виброцил терапевтического эффекта отмечено не было. При использовании в качестве терапии исследуемого препарата фрешнос был показан выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект в отношении количества бокаловидных клеток. Наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдался при использовании исследуемого препарата в дозах 20 и 30 мкл/100 г массы тела, количество бокаловидных клеток было идентично уровню интактных животных.

На фоне применения всех исследуемых препаратов во всех дозах было показано выраженное снижение инфильтрации слизистой оболочки и

подслизистого слоя лейкоцитами. Во всех группах данный показатель был одинаково статистически значимо снижен по сравнению с контрольными животными. Такие данные свидетельствуют о наличии у всех исследуемых препаратов выраженного противовоспалительного действия.

Таким образом, при гистологическом исследовании носовых ходов крыс в ходе экспериментального моделирования острого риносинусита, был выявлен выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект препарата фрешнос, что характеризовалось регенерацией эпителия, снижением количества бокаловидных клеток и степени выраженности инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами. Установлено, что препарат значимо превосходил по своему противовоспалительному эффекту препараты сравнения.

Полученные данные об эффективности исследуемого препарата фрешнос обусловлены его многокомпонетным составом и подтверждаются многочисленными литературными данными, свидетельствующими об эффективности его компонентов в отношении различных признаков воспаления.

Диссертационная работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, в рамках:

1. Государственного контракта № 16.512.11.2020 от «10» февраля 2011 г. «Изучение механизмов противоаллергического ветеринарного средства на основе комплексной переработки печени рыб семейства Gadidae» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы».

2. Государственного контракта №8330р/13249 от 31.08.2010 «Разработка субстанции, обладающей противовоспалительным, противомикробным и противовирусным действием, для получения нового лекарственного средства для лечения острых и хронических ринитов».

Полученные экспериментальные данные в отношении эффективности применения препарата фрешнос послужили основанием для проведения клинических испытаний, которые были инициированы и успешно проведены на базе отоларингологического отделения Городской Клинической больницы №1 им.

Н.И.Пирогова г. Москвы под руководством академика Международной академии оториноларингологии - Хирургии головы и шеи, члена-корреспондента Российской академии медицинских наук, заслуженного деятеля науки РФ, профессора Владимира Тимофеевича Пальчуна и на базе ФГБУ "СПб НИИ ЛОР" Минздрава России под руководством профессора Юрия Константиновича Янова.

Результаты экспериментального исследования препарата КЛС-04 вошли в досье на препарат для получения последующего разрешения на проведение клинических испытаний.