2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Критерии включения в исследование

Подтвержденный диагноз хронической обструктивной болезни легких

Индекс курения не менее 10 пачка/лет

Возраст 40-75 лет

фаза стабильного течения (не менее 4-х недель с окончания предшествующего обострения)

Способность больного выполнять необходимые процедуры, связанные с исследованием

Критерии исключения

сопутствующие болезни органов дыхания (рак, туберкулез, пневмония, БА и др.)

острые или обострения хронических воспалительных заболеваний других органов

прием системных кортикостероидов

злокачественные новообразования любой локализации

компьютерная томография любой зоны, проведенная в течение 6 месяцев до исследования

противопоказания к лучевой нагрузке (беременность, лучевая терапия в анамнезе)

Этапы исследования

Исследование состояло из 4-х этапов (табл.1).

Таблица 1.

Этапы исследования

Пациенты

В исследование были включены 64 больных (12 женщин/52 мужчины) средний возраст 60,4+8,9 лет со стажем курения 39,8+16,2 пачка/лет, из них 28% экс-курильщики и 72 % продолжали курить, соответствовавшие критериям включения-исключения (Табл.2). Кроме того, в исследовании участвовали 5 больных (все мужчины), перенесших хирургическую редукцию объема легких.

Оценка клинических симптомов заболевания проводилась в баллах:

Таблица 2.

Характеристика больных, включенных в исследование

Кашель ( 0 баллов - нет кашля, 1 балл- кашель, не нарушающий дневной активности и сна, 2 балла - кашель, ограничивающий дневную активность и сон, 3 балла - непрерывный кашель, не позволяющий выполнять обычные нагрузки

Продукция мокроты ( 0 баллов - отсутствие мокроты, 1 балл - до 20 мл.

Одышка оценивалась пациентами самостоятельно по модифицированной 10 балльной шкале Борга (0 баллов – нет одышки до 10 баллов – невыносимая одышка, удушье).

Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывался по формуле:

ИМТ=Вес (кг)/Рост² (м)

Индекс курения (ИК) рассчитывался по формуле:

ИК (пачка/ет) = Количество выкуриваемых сигарет в день/20 х стаж курения (годы)В течение 12 месячного периода наблюдения больным проводилось лечение в соответствии со стандартами GOLD пересмотр 2003 г

Через 12 месяцев после проведения стандартной терапии из 64 больных ХОБЛ исследование завершили 32 пациента.

Оценка динамики течения ХОБЛ проводилась по параметру ОФВ1. Оценивалась качественная (увеличение или снижение ОФВ1) и количественная (% изменения ОФВ1) динамика. Увеличение ОФВ1>0,4% /год от должных величин расценивалось как прирост, а меньшие цифры как падение (Sandford AJ et al. 2001),.

Иммунологические методы исследования биомаркеров

Определение уровня альфа-1-антитрипсина в сыворотке крови проводилось методом нефелометрии. Исследование проводилось при помощи нефелометра BN ProSpec фирмы DADE BEHRING, (США-Германия).

Для определения активности нейтрофильной эластазы (НЭ), матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9), тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (ТИМП-1), интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), трансформирующего фактора роста-бета (TGF- β), эндотелиального фактора роста (VEGF) использовались наборы фирмы BIOSOURCE (США), Bender MS (Швейцария). Исследование проводилось методом иммуноферментного анализа в соответствии с рекомендациями производителя. Постановка реакций выполнялоась методом парных сывороток. В случае несоответствия результатов, пара выбраковывалась

Функциональные методы исследования

Бодиплетизмография

Общеплетизмографическое исследование проводилось на универсальной трансмуральной бодикамере (Autobox DL Body 6200, Sensor Medics, США) , осуществляющей одновременно плетизмографию давления и плетизмографию объема. Спирометрия с анализом кривой поток-объем выполнялась по стандартной методике.

Диффузионная способность легких

Исследование диффузионной способности легких для СО методом одиночного вдоха с задержкой дыхания осуществлялось с использованием мультигазового анализатора быстрого ответа

Исследовались следующие показатели: удельная диффузионная способность легких (TLCOva), общая диффузионная способность легких (TLCOsb) и их процентные значения.

Неинвазивная оценка гемодинамики проводилась при помощи допплерэхокардиографии на ультразвуковом анализаторе Vivid-7 (“General Electric”, США). Исследование проводилось в стандартных эхокардиографических доступах: парастернальном, апикальном, субкостальном.

Определение максимального систолического давления в легочной артерии (СДЛА) проводили в постоянно-волновом допплеровском режиме. Cистолический градиент давления между правым желудочком (ПЖ) и правым предсердием (ПП) рассчитывался по уравнению Бернулли с использованием пиковой скорости потока трикуспидальной регургитации:

pGтк=4?Vmax²,

где pG-градиент давления между ПЖ и ПП, Vmax – максимальная скорость потока трикуспидальной регургитации (Berger M. et al., 1985).

Регистрация потока трикуспидальной регургитации производилась из апикального и/или субкостального доступа.

Сумма транстрикуспидального градиента давления и давления в ПП (Pпп) принималась равной систолическому давлению в ЛА (PAPs) (при отсутствии стеноза клапана легочной артерии):

PAPs=PGтк+Pпп Рентгенологическое исследование:

Спиральная компьютерная томография выполнялась на спиральном компьютерном томографе Somatom EMOTION (Siemens, Германия).

Технические параметры сканирования: направление - кранио-каудальное; положение пациента - на спине, руки убраны за голову; коллимация (толщина среза) 5 и 2 мм., (срезы с высоким разрешением – КТВР), pitch 1,5 (отношение скорости стола к времени оборота трубки), сила тока (кВ) =130, мощность (мАс)= 90.

При проведении КТ определялись: формы и распределение эмфиземы, средняя плотность легочной ткани (СрПЛ) в единицах Хаунсфилда (ед. Х), количество легочной ткани в диапазоне плотности от -950 до – 1000 ед.Х (ЛТ -950), денситометрический индекс эмфиземы (ДИЭ), рассчитанный как отношение рассчитанной ЛТ-950 к предельно допустимым ЛТ-950; бронхоэктазы, участки пневмофиброза, плевральных сращений, также других изменений легочной ткани. Гистологическое исследование

Кусочки ткани легких фиксировали в 4%-ном нейтральном формалине. После обезвоживания в спиртах восходящей крепости заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином и фукселином.

Для полуколичественной оценки выявленных гистологических изменений (очаговый фиброз, лимфоидная инфильтрация, макрофагальная инфильтрация) использовали балльную шкалу оценки от 0 (отсутствие изменений) до 6 (выраженные изменения). Макрофагальную инфильтрацию межальвеолярных перегородок оценивали на иммуногистохимически окрашенных срезах. Для выраженности изменений сосудов также применяли балльную оценку, однако анализировали с учетом выраженности изменений (от 0 до 3 баллов) и доли измененных сосудов (от 0 до 3 баллов), при этом полученные баллы суммировали.

Иммуногистохимическое исследование Иммуногистохимические исследования проводили по общепринятой методике (Boon M.E., Kok L.P., 1987) на депарафинированных срезах толщиной 5 мкм, расположенных на стеклах, покрытых APES, c предварительной демаскировкой антигена с применением микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе цитратного буфера с pH 6,0. Блокирование эндогенной пероскидазы проводили путем обработки срезов в течение 20 минут в 0,03% перекиси водорода на метаноле. Использовали моноклональные антитела к VEGF, MMP-9, TIMP-1, TGF-β1 (“Novocastra”, England), SMA (Scytek, USA).

Результаты иммуногистохимических реакций оценивали в баллах – от 0 (отсутствие экспрессии маркера) до 6 (максимальная экспрессия) методом полуколичественного анализа с учетом числа окрашенных клеток (макрофагов, эпителиальных клеток), а также интенсивности окрашивания (эндотелий).

Статистическая обработка результатов

Данные описательной статистики представлены как выборочное среднее ± стандартное отклонение. Данные концентраций сывороточных биомаркеров приведены как медиана (25-75%). Достоверность различий между исследуемыми группами в случае параметрического распределения признаков оценивалась при помощи непарного t-критерия Стьюдента. В случае непараметрических данных сравнение проводилось методом Манна-Уитни. Корреляционные связи определяли методом линейной корреляции при параметрических данных и методом ранговой корреляции Спирмена при непараметрическом распределении. Оценка влияния различных факторов на вероятность событий провдился при помощи метода регрессионного монофакторного анализа, а затем мультифакторного анализа (для достоверных признаков по результатам монофакторного анализа). Количественный расчет пограничных параметров для предсказания вероятности события проводился при помощи дискриминантного уравнения.

Различия считались статистически достоверными при p