Материал и методы исследования.

Выбор применяемой нами модельной биологической системы оценки уровня окислительной модификации белков и молекул средней массы был обусловлен ее способностью реагировать на изменение уровня свободно­радикальных процессов.

В работе были использованы в качестве базовой модельной биологиче­ской системы желточные липопротеиды, полученные по методике Г.И. Кле­банова и соавт. (1988). В соответствии с указанной методикой, желточные липопротеиды - одна из модельных систем, позволяющая оценить антиокси­дантную активность исследуемых веществ и чувствительная к инициации свободно-радикальных процессов ионами Fe²⁺.

К модельной биологической системе добавляли сыворотку крови бе­лых беспородных крыс (самок и самцов) и продукты пчеловодства - пропо­лис, гомогенат трутневого расплода, мед, маточное молочко (препарат «Апилак»), в виде 30 % водных растворов. Протокол приготовления раство­ров продуктов пчеловодства для исследования in vitro был стандартизирован. Растворы прополиса, гомогената трутневого расплода и препарата «Апилак» готовили по методике, аналогичной предложенной Е.А. Дубцовой (2009).

Продукты пчеловодства, по данным литературы (Ю.Л. Баймурзина, 2002; Л.Р. Ялалетдинова и соавт., 2011), обладают различной степени выра­женности антиоксидантной активностью.

Считается, что по уровню белков трутневый расплод идентичен маточ­ному молочку, но выраженно отличается от него по показателям окисляемо- сти. Трутневый расплод содержит меньшее количество ненасыщенных со­единений, о чем свидетельствует показатель окисляемости, коррелирующий с меньшим количеством деценовых кислот. (Л.А. Бурмистрова, 1999.) По данным Т.В. Вахониной (1995), в личинках деценовые кислоты содержатся в основном в связанном состоянии, в виде эфиров с миристиновой, пальмити­новой, стеариновой и себациновой кислотами; их уровень в трутневом рас­плоде составляет около 42% от количества в маточном молочке.

Прополис может оказывать антикатаболический и антиоксидантный эффекты (Ш.М. Омаров, А.Ш. Омаров, 1995).

Н.И. Белостоцкий и соавт. (2009) отметили наличие у меда, маточного молочка и прополиса общего конечного функционального вектора воздей­ствия на экспериментально вызванный язвенный процесс, а именно репара­ционного заживляющего вектора, который выражается в ускорении зажив­ления язвенного дефекта. При этом конечный репарационный вектор являет­ся для различных исследованных продуктов результирующей различных по составу и интенсивности внутренних процессов, определяемых их функцио­нальным воздействием на различные звенья патогенеза язвенного процесса. Для меда выделяют несколько элементов воздействия: стимуляция эндоген­ных антиоксидантных систем, общее анаболическое действие, стимуляция цитопротекции. Действие прополиса основано на его противовоспалитель­

ных и антиоксидантных свойствах. Маточное молочко обладает антиокси­дантными свойствами и способно воздействовать на все виды метаболизма.

Продукты пчеловодства - это биологически активные вещества, со­держащие белки, липиды, углеводы, витамины, минеральные вещества, эн­зимы, гормоны и благодаря своей высокой биологической активности спо­собные влиять на множество функций организма (Е.А. Дубцова, 2009).

Таким образом, применение выбранной модельной биологической си­стемы может служить основой для изучения окислительной модификации белков в комплексе с молекулами средней массы. Изучение биохимических особенностей продуктов пчеловодства по исследуемым тестам может быть перспективно в плане дальнейших разработок фармакологических препара­тов и индикаторных тест-систем оценки свободно-радикальных процессов.

В соответствии с поставленной целью и задачами исследования были сформированы серии наблюдений в условиях спонтанного и Fe²⁺- индуцированного окисления:

I. в изучаемой модельной биологической системе (желточные липопро­теиды), а также в сыворотке крови крыс, продуктах пчеловодства (прополис, гомогенат трутневого расплода, мед, маточное молочко);

II.

III. в модельной биологической системе с одновременным добавлением продуктов пчеловодства и сыворотки крови экспериментальных жи­вотных (крысы).

Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном рационе питания. Кровь у крыс забиралась из хвосто­вой вены, с соблюдением необходимых требований к проведению экспери­ментов.

В каждой серии наблюдений эксперименты проводили в 7 повторно­стях.

Схема построения серий наблюдений в модельных биологических си­стемах (МБС) в условиях спонтанного и Fe^-индуцированного окисления показана на рисунке 1.

Изучались уровни окислительной модификации белков (ОМБ) в пуле молекул средней массы (МСМ) с помощью разработанного способа (патент на изобретение Российской Федерации № 2525437, в соавторстве).

Спецификой метода, используемого нами, является его нацеленность на увеличение информативности биохимических тестов определения МСМ и ОМБ путем исследования их в комплексе - в одной и той же пробе и сниже­ние расхода биологического материала (рисунок 2). Т.е. одновременно в пробах производят определение уровня и МСМ, и ОМБ.

Рисунок 1. Схема построения серий наблюдений в модельных биологиче­ских системах (МБС) в условиях спонтанного и Fe^-индуцированного окис­ления.

Для проведения измерений экстинкций МСМ (при 254 нм) и ОМБ (при 356 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм) использовался спектрофотометр СФ-2000 (лаборатория кафедры биохимии Пензенского государственного университе­та).

Рисунок 2. Схема метода оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы.

Для обработки и интерпретации полученных результатов применены стандартные методы статистического анализа полученных данных с исполь­зованием компьютерной программы «Excel»: вариационная статистика для малых выборок с применением t-критерия Стьюдента, корреляционный ана­лиз (С.

Результаты собственных исследований.

В нашей работе применена модельная биологическая система желточ­ных липопротеидов, на которой исследованы уровни окислительной моди­фикации белков и молекул средней массы по запатентованному способу (па­тент на изобретение Российской Федерации № 2525437, в соавторстве).

Комплексная оценка величин МСМ и уровней ОМБ при спонтанном и 2+

Ре -индуцированном окислении проведена:

1) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Fe²⁺- индуцированном окислении (уровень МСМ показан на рисунке 3);

2) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства (уровень МСМ пока­зан на рисунке 4);

3) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс (уровень МСМ показан на рисунке 5).

Рисунок 3. Уровни МСМ в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления сыворотки крови 2+

крыс при спонтанном и Fe -индуцированном окислении (* - p