ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ХОЛЕРЫ

IV

1) Ag + HCl + пепсин + Xb →Iα (pH 10;

2) At + Gt + цистеин + глутатион (восст.) → 10;

3) At + Gt + липаза → Ip .

В этих циклах At — антитоксины; Gt — холерные токсины; 10 — нейтрализация токсинов; Ip — разрушение токсинов.

Необходимо отметить, что в приведенных молекулярных циклах взаимодействие антител с ферментами проявляется при разведении сывороток 1:250 и выше.

Группа VII иммунных циклов, существование которых предполагается, обусловливает связывание некоторых фраг­ментов антигенов гликолипидами и сегрегацию их в гранулы клеток иммунной системы:

А + Gf ÷ PS # Im.

В этих циклах А — антитела к антигенам холерных вибри­онов; Gf — антигенные фрагменты; PS — белок гликолипид; Im — сегрегация.

Опыты на животных позволяют предположить, что иммун­ные циклы IV (3, 4, 6, 7), V (2, 3) и VI (1, 2, 3) функци­онируют в полости тонкой кишки; IV (1, 4, 5—7), V (1, 2) и VI (1, 2, 3) - в энтероцитах; IV (1-7), V (1-3), VI (1, 3) и VII-B фагоцитах; IV (1), V (2, 3) и VI (1—3) —в плазме крови.

Механизмы общих факторов иммунитета при иммунизации существующими вакцинами формируются достаточно активно [Адамов А.К. и др., 1972; Адамов А.К., 1980, 1981; Назарова 28* 427

Л.С., 1981], за исключением антиферментных иммунных цик­лов.

Ведущими в защите от холерных вибрионов являются ме­стные факторы иммунитета. Местные — иммунотканевый и арецепторный — факторы направлены на предупреждение ад­гезии холерных вибрионов к энтероцитам и разрушение кле­ток холерных вибрионов. Холерные вибрионы, попадая в тон­кую кишку человека, чтобы вызвать заболевание, должны адгезироваться на энтероцитах. Токсин также вызывает пато­логический процесс только после связывания с клеточными рецепторами. Механизмы, направленные на блокирование адгезии и взаимодействия токсина с рецептором, объединены нами в арецепторный фактор.

Согласно сообщению E.S. Fubara и R.Freter (1973), адгезия вибрионов на энтероцитах зависит от активности в них гли­колиза. При ингибировании гликолиза количество адгезиро­вавшихся вибрионов на энтероцитах возрастает. В иммунном организме адгезию вибрионов подавляют антитела к О- и Н-ан- тигенам [Клюхин С. и др., 1927; Самострельский А.Ю. и др., 1978; Freter R., 1969—1974]. Расчеты, произведенные нами по данным W.Chaicumpa и D.Rowley (1972), показали, что для подавления адгезии необходимо, чтобы в содержимом тонкой кишки титр антител к О-антигенам был не ниже 3∙10⁶ BE. Для подавления адгезии у человека ему требуется ввести пе­рорально 3 ∙ IO⁹ BE.

Как показали исследования на животных, практически невозможно путем активной иммунизации обеспечить содер­жание вибриоцидных антител в кишечном секрете в титре, равном 3-Ю⁶BE. Поэтому только этот механизм защиты не может обеспечить невосприимчивость организма к холерной инфекции [Адамов А.К., 1980].

Кроме антиадгезивного действия антител, существенным механизмом арецепторного фактора является блокада анти­токсинами связывания токсина с рецепторами энтероцитов. Активной частью рецептора является ганглиозид Gml. Кроме того, нами установлено, что при иммунизации холерным анатоксином в энтероцитах уменьшается содержание гангли­озида Gml [Адамов А.К., Павлова Ю.П., 1979]. При вакцина­ции возможны следующие механизмы снижения активности рецепторов в энтероцитах: 1) уменьшение синтеза ганглиози­да Gml; 2) полимеризация ганглиозида Gml с образованием димеров и более сложных его полимеров, не связывающих экзотоксин; 3) усиленное выделение из энтероцитов гангли­озида Gml. При иммунизации морских свинок мы наблюдали в крови увеличение концентрации ганглиозидов, не связыва­ющих холерный экзотоксин.

Одновременно с механизмами, блокирующими адгезию, в энтероците функционирует сорбционный механизм, который, 428

по нашим представлениям, способствует разрушению холер­ных вибрионов. При этом для разрушения холерных вибрио­нов энтероциты адсорбируют их на микроворсинках в опреде­ленных зонах, где функционируют иммунные молекулярные циклы, вызывающие гибель холерных вибрионов. Иммунный энтероцит в этих зонах цитоплазматической мембраны со­держит специфические антитела и функционирует как сво­еобразный иммуносорбент. На поверхности цитоплазматичес­кой мембраны (см. табл. 103 и 104), вероятно, функциониру­ют I, IV—1, 2, 3, 4, 5; V—1, 2, 3 и VI — 1—3 иммунные молекулярные циклы [Адамов А.К., Малыхина З.В., 1978]. По-видимому, указанные механизмы обеспечивают бактери­цидное действие слизистой оболочки тонкой кишки иммун­ных животных, обнаруженное R.Freter (1969—1974), E.S. Fubara и R.Freter (1973), W.Chaicumpa и соавт. (1972), LKnop и R.Rowley (1975), а также подавление подвижности, отмечен­ное LKnop и J.E. Bellamy (1976). Живые изолированные эн­тероциты совместно с антителами также действуют вибрио- цидно [Freter R., 1970]; мертвые энтероциты — слабо инги­бируют размножение вибрионов [Адамов А.К. и др., 1977]. При нарушении кровоснабжения слизистой оболочки бакте­рицидное действие ее снижается. Эти данные подтверждают существенную роль неспецифического компонента в иммун­ных циклах и бактерицидное действие слизистой оболочки тонкой кишки.

Гуморальный местный фактор объединяет защитные меха­низмы кишечного секрета. В нем, по-видимому, функциони­руют (см. табл. 104 и 105) иммунные циклы: II, III, IV — 2, 4; V — 2, 3 и VI. Антитела, содержащиеся в кишечном соке, блокируют адгезию вибрионов к энтероцитам.

Слизь, содержащая антитела к О- и Н-антигенам, выпол­няет роль барьера, замедляющего продвижение холерных виб­рионов к энтероцитам. Согласно сообщению G.D.Schrank и W.F.Uerwey (1976), если слизь содержит антитела, то холер­ные вибрионы не могут проникнуть через этот барьер к мик­роворсинкам энтероцитов. Вблизи ворсинок, где концентра­ция антител и ферментов высокая, они наблюдали подавле­ние размножения холерных вибрионов.

Содержимое тонкой кишки — химус, в котором много клетчатки (целлюлозы), также выполняет защитную функцию путем адсорбции на частицах клетчатки холерных вибрионов и, вероятно, их токсинов. В иммунном организме клетчатка в тонкой кишке содержит и антитела. В связи с этим ее можно рассматривать как подвижный иммуносорбент.

В экспериментах на белых мышах LKnop и D.Rowley (1975) установили, что у иммунных животных холерные вибрионы быстрее элиминируются из тонкой кишки в толстую.

Взаимодействие иммунотканевого, арецепторного, гумораль-

ного и регуляторного местных факторов иммунитета коорди­нируется кишечником — органом, для которого характерен элиминационно-хроматографический фактор. Кишечник по­средством перистальтики обусловливает перераспределение вибрионов по слизистой оболочке, с тем чтобы на каждый энтероцит сорбировалось, вероятно, не более 1 вибриона. При этом условии иммунные энтероциты способны умертвить хо­лерный вибрион, адсорбировав его на своей цитоплазмати­ческой мембране в зоне действия иммунных молекулярных циклов. Органный фактор, следовательно, способствует пере­распределению вибрионов в кишечнике (своего рода хрома­тографии), а также сорбции на энтероцитах и частицах химуса. Кроме того, органный фактор обеспечивает выведение их из тонкой кишки в толстую и во внешнюю среду. Органный элиминационно-хроматографический фактор мы рассматрива­ем как очень эффективный механизм защиты. Достаточно напомнить, что из организма тяжелобольного холерой по­средством этого защитного фактора ежедневно выводится 2 ∙ IO¹³ вибрионов (или примерно 0,5 г вибрионов).

Другие перечисленные выше местные факторы иммунитета еще только изучаются.

Следует подчеркнуть, что основу иммунитета к холере составляют антимикробные механизмы [Адамов А.К. и др., 1973, 1975; Адамов А.К. и др., 1981 — 1990; Адамов А.К., Ада­мов О.А., 1990; Pierce N.F. et al., 1988].

При иммунизации холерными вакцинами, так же как и в организме больного, формируется функциональная система искусственного иммунитета, которая обеспечивает своевре­менное распознавание проникших в организм возбудителей холеры и гармоническое активирование всех факторов имму­нитета [Адамов А.К., 1981].

Для обеспечения защиты мобилизуются метаболические процессы, обеспечивающие иммунные механизмы необходи­мыми ферментными звеньями, модуляторами и энергией.

Метаболическая перестройка организма при формирова­нии иммунитета чрезвычайно сложна. После многих почти безуспешных попыток, предпринятых в начале текущего сто­летия, исследования в этом направлении в последующие годы проводились не систематически. C 1968 г. в лаборатории инсти­тута «Микроб» ведется изучение указанных проблем. В экспе­риментах установлено, что при иммунизации активируется метаболизм посредством адаптационных механизмов и меха­низмов, участвующих в реализации стресс-реакции [Горькова А.В. и др., 1972; Козырева Л.А. и др., 1984; Шанин И.В., 1987; Соболев С.М., Степанова Т.М., 1987; Щуковская Т.Н., Горь­кова А.В., 1988; Дмитриева В.П. и др., 1990; Адамова Г.В. и др., 1988; Мохин К.М. и др., 1989], причем активирование метаболизма направлено на генерирование энергии, которая

используется для синтеза антител, разрушения антигенов, и на компенсирование изменений в организме с целью обеспе­чения нормальной его жизнедеятельности [Адамов А.К., 1970* Горькова А.В. и др., 1972; Назарова Л.C., 1981; Наумшина М.С. и др., 1987, 1989; Хакимов М.М., Абдулаев А.И., 1988].

Сложным и еще малоизученным следует признать материн­ский иммунитет. По-видимому, кроме специфических антител секретируемых с молоком, в формировании материнского иммунитета участвуют и некоторые ферменты, содержащиеся в молоке (лактопероксидаза и ряд других). В экспериментах на животных доказано, что молоко иммунизированных холерны­ми антигенами коз и коров при пероральном введении защи­щает их от заболевания холерой [Адамов А.К., 1980; Shimamura Т. et al., 1981; Boesman-Finkelstein М. et al., 1989].

Формирование иммунных механизмов происходит под вли­янием антигенов холерных вибрионов, относящихся к детер­минантам вирулентности. По мнению А.К. Адамова (1975, 1980, 1981, 1984), холерные вибрионы содержат более 15 детерми­нант вирулентности: 1) антиген 1 (Н, подвижность); 2) по­ложительный хемотаксин — детерминанта Vt; 3) детерминан­та адгезии и межмембранного кооперативного взаимодей­ствия — δ; 4) антиген-9 (термолабильный антиген, обеспечи­вающий защиту вибрионов от действия желудочного сока);

5) S-форма колоний; 6) антиген 15 (слизь); 7) Pt-комплекс транспортных ферментов; 8) Ft — комплекс трофических фер­ментов; 9) Fd — констелляция деструктивных ферментов; 10) W — вибриоцины; 11) Lg-комплекс ферментов, обеспе­чивающих деление клетки; 12) антиген 13 — энтеротоксин; 13) антиген 14 — мембранотоксин; 14) антигены 2, 3, 4 — экзотоксины; 15) сидерфор — белок, транспортирующий ион железа в клетку вибрионов.

При анализе возможности формирования иммунных меха­низмов под влиянием разных антигенов [Адамов А.К., 1981], инактивирующих указанные детерминанты, получены следу­ющие данные. Подавление адгезии, подвижности и действия эндотоксина обеспечивают антитела к термостабильным O- антигенам 2, 3 и 4. Гемагглютинин не вызывает образования защитных механизмов [Svennerholm А.-М. et al., 1983]. Анти­токсины эффективно нейтрализуют холерные экзотоксины. Не исследована эффективность специфических антител в инакти- вировании вибриоцинов, антигена 9 и ферментов, обеспечи­вающих деление вибрионов. Инактивирование ферментов, входящих в детерминанты Pt, Ft и Fd, возможно иммунными антителами против этих ферментов. Однако они обладают слабыми антигенными свойствами. Антиферментные антите­ла, согласно гипотезе А.К. Адамова, занимают центральное место в формировании искусственного иммунитета к холере. Организм, блокируя с помощью антиферментных антител

транспорт веществ в клетки вибрионов и некоторые метабо­лические процессы, обусловливает их гибель от дефицита энергии [Адамов А.К., 1975, 1980, 1981]. В связи с низкой антигенной активностью ферментов ведется углубленное изу­чение способов усиления иммуногенности ферментов, входя­щих в детерминанты Pt, Ft, Fd и другие неизученные детер­минанты, а также поиски адъювантов для ферментов.

По мнению Д.Роули (1983), липополисахарид (эндоток­син) не играет существенной роли в формировании иммуни­тета к холере. Этот автор считает, что иммунитет к холере обусловлен действием экзотоксина и лабильных белковых антигенов. По нашим наблюдениям, формирование иммуни­тета происходит под влиянием антигенных детерминант виру­лентности в оптимальных для иммуногенеза соотношениях [Адамов А.К., 1975, 1980, 1981].

Использование новых антигенных комплексов и ферментов при конструировании холерных вакцин требует разработки новых методов определения иммунологической перестройки организма.

Широко изученные О- и Н-антигены активируют с помо­щью образовавшихся против них антител иммунные молеку­лярные механизмы, эффективно функционирующие только при достаточно высоких титрах антител. Надежная защита лигированных петель тонкой кишки кроликов от заражения холерными вибрионами наблюдалась у животных, иммунизи­рованных путем внутрижелудочного 3-кратного ежедневного введения по 40 мг убитых вибрионов и холерного анатоксина на 1 кг массы тела в течение 3 дней [Адамов А.К., Волоси- вец А.И., 1979, 1990]. Возможно, у животных, иммунизиро­ванных большими дозами микробных клеток, в индукции иммунных механизмов принимают участие не только О- и H- антигены, но и еще неизвестные слабые антигены вибрио­нов, не проявляющие иммунологической активности при введении небольших доз убитых вибрионов.

По данным TJshihara и соавт. (1980), у мышей иммунитет к внутрибрюшинному заражению холерными вибрионами регистрировался только после ежедневных 3-кратных введе­ний перорально по 30—60 мг убитых вибрионов на 1 кг массы тела. У мышей линии ddN он обеспечивал 100 % защиту, у животных других линий — от 14 до 60 %. В то же время в сыворотке крови не обнаруживались антитела к О- и Н-анти- генам.

В соответствии с приведенными данными, для формирова­ния иммунитета у человека ему необходимо вводить ежеднев­но 50—60 мг антигенов холерных вибрионов на 1 кг массы тела в течение 3 дней (разовая доза в среднем 4—4,8 г на человека в день).

Многие исследователи в последние годы ведут поиск еще

неизвестных антигенных детерминант и протективных антиге­нов. Так, согласно сообщениям В.Gustafsson и J.Holme (1983) C.V.Sciortino и соавт., (1985), T-Ito и соавт., (1987), L.Zhu и Sh-Zhang (1988), липополисахарид из холерных вибрионов серовара Огава содержит антигенные детерминанты, общие для сероваров Огава и Инаба, а также серовароспецифичес- кую детерминанту Огава. Свойством агглютинировать холер­ные вибрионы обладали только антитела к липополисахари­дам О-видовому, Огава и Инаба [Sciortino C.V. et al., 1965]. Липополисахарид обладает слабой иммуногенностью [Forrest B.D. et al., 1989].

По данным J.Shimada и соавт. (1987), детерминанта серова- роспецифического антигена Инаба синтезируется в клетках

V. fluvialis группы 19.

Комплекс генов, кодирующих синтез О-антигенов холер­ных вибрионов, был клонирован Р.А. Monning и соавт. (1986) в штамме E.coli К-12. Посредством рестрикционного анализа клонов они обнаружили, что примерно 15 kb относились к общим О-антигенам клонов, последующие 15 kb содержали клоны Огава. Антитела к штамму К-12, содержащему клон pPM IOOl (детерминанта холерного О-антигена Инаба), при пероральном введении защищали мышей-сосунков от перо­рального заражения холерными вибрионами.

У энтеропатогенных вибрионов с помощью холерной О-аг- глютинирующей сыворотки был обнаружен антиген, общий с антигеном холерных вибрионов (не относящийся к видовому и серовароспецифическим О-антигенам), который не вызы­вал у кроликов образования гомологических антител [Адамов А.К., Щуркина И.И., 1975]. По данным J.Shimada и соавт. (1987), детерминанта серовароспецифического антигена Ина­ба синтезируется в клетках V-Auvialis группы 19. Иммуноген­ность и свойства дермадекротоксина недостаточно изучены [Ефимцева Е.П., 1963; Помухина О.И., Уралева В.С. 1987, 1988, 1989; Исупов И.В. и др., 1990; Watanabe Y., Verwey W.F., 1965].

Среди белков наружной мембраны холерных вибрионов Sh.Kabir (1980), J.F.Kelley и Gh.D. Parker (1981), Т.А.Аболина и соавт. (1987) обнаружили слаботоксичные антигены с моле­кулярной массой 68 000, 48 000, 45 000, 1300. По данным A.Faris и соавт. (1982), S.Kabir и A-Showkat (1983), поверхно­стные белки, обладающие гидрофобными свойствами, спо­собствуют адгезии холерных вибрионов.

H-Yamaguchi и соавт. (1986) с помощью иммуноэлектрофо­реза обнаружили новый перекрестно реагирующий белок у 11 видов бактерий, в том числе и в клетках холерных вибри­онов. Он характеризовался молекулярной массой 60 000.

Sh.Kabir (1989) с помощью перекрестного иммуноэлект­рофореза обнаружил в клетках холерных вибрионов Ol серо-

вара 30 мигрирующих к аноду антигенов, одним из которых был липополисахарид. Большинство из них по свойствам от­носились к белкам. Часть из них располагалась на наружной мембране; основной белок наружной мембраны находился в тесной связи с липополисахаридом.

Согласно сообщению D-Sengupta и соавт. (1989), белки наружной мембраны OMP холерного Ol серовара и не Ol серовара имеют много общего в антигенной структуре. Они обнаружили общие антигенные свойства у белков наружной мембраны с массой 36 000 и 25 000—26 000 холерных вибри­онов 01 и не 01 серовара. Сыворотки против этих антигенов защищали кроликов от заражения их холерными вибрионами в лигированные петли тонкой кишки.

Используя моноклональные антитела, C.V.Sciortino и соавт. (1985), С.V-Sciortino (1989) выявили среди белков наружной мембраны холерных вибрионов, выращенных на агаре с мяс­ным экстрактом, антиген OMA с молекулярной массой 18 000. Моноклональные антитела против этого антигена при перо­ральном введении в смеси с холерными вибрионами защища­ли 90% животных от заболевания (в контроле 99% животных погибало), но в кишечнике полной гибели вибрионов не происходило. В содержимом кишечника они обнаруживались в концентрации 108 и выше. Причины этого явления остались необъясненными. Антитела против других 5 антигенов наруж­ной мембраны и липополисахарида не защищали животных от заражения холерными вибрионами.

J.Pochlner и соавт. (1986), М.В. Jalajakumari и Р.А. Manning (1990) выявили последовательности нуклеотидов, кодирую­щие информацию о белках наружной мембраны холерных вибрионов с молекулярной массой 22 000.

По данным V.L. Miller и J.J. Mekalanos (1988), 2 основных белка наружной мембраны OmpT и OmpU находятся под контролем гена toxR. Экспрессия этих белков, токсина и TcpA (пилевого фактора колонизации) зависит от концентрации аспарагина, аргинина, глутаминовой кислоты и серина. Тем­пература и pH влияют преимущественно на экспрессию хо­лерного токсина и TcpA. По-видимому, перечисленные выше факторы служат регуляторными сигналами для гена toxR.

В капсуле жгутиков холерных вибрионов обнаружены 3 по­липептида молекулярной массой 61 500, 60 000 и 56 500 [Hranit- zky К.W et al., 1980].

C помощью моноклональных антител TJto и Т.Yokota (1987) установили, что холерные вибрионы синтезируют 2 типа ан­тигенов: 1-й тип антигенов после прогревания не утрачивает свойства образовывать типичные агглютинаты; 2-й тип после прогревания вместо крупных образует мелкозернистые агглю­тинаты.

По данным GJonson и соавт. (1989), холерные вибрионы,

выращенные в лигированных петлях тонкой кишки в нелиги- рованной тонкой кишке, экспрессировали 7—8 белков кле­точной оболочки, не обнаруживаемых в вибрионах, культиви­руемых на обычных лабораторных средах. Некоторые белки, обнаруживаемые в наружной мембране выращенных in vitro вибрионов, в выращенных in vivo вибрионах обнаруживались в меньшем количестве. Новые белки не индуцировались при выращивании вибрионов в среде, лишенной железа, что ука­зывает на их отличие от белков системы транспорта железа. Изменения профиля белков наружной мембраны при выра­щивании in vivo разных штаммов вибриона было закономер­ным. Новые белки обладали антигенными свойствами.

K-Richardson и соавт. (1989) исследовали с помощью им­муноблоттинга специфичность иммуноглобулинов в сыворот­ке и кишечном секрете людей — добровольцев, зараженных холерными вибрионами Ol серовара. Они установили, что в холерных вибрионах синтезируется 3 типа белковых антиге­нов: антиген і содержался в вибрионах обоих сероваров и биоваров; антиген іі — в штамме, которым заражали добро­вольцев; антиген ііі — в выращенных in vivo вибрионах. C этими антигенами, относящимися к белкам наружной мемб­раны клеток с молекулярной массой менее 25 000, реагиро­вали сывороточные IgG- и секреторные IgA-антитела добро­вольцев.

H. Fujsawa и соавт. (1987) в опытах на мышах линии BALBC, иммунизированных холерной живой вакциной, обнаружили, что освобождение их кишечника от вибрионов происходит под управлением антител против нового антигена, синтезиро­ванного живой вакциной в организме этих животных, во время их иммунизации. Вероятно, новый антиген представляет со­бой фермент, выполняющий важную функцию в клетках виб­рионов, активность которого подавляется антиферментными антителами.

Новый антиген у холерных вибрионов, образующийся в определенной питательной среде, открыли M.Ehara и соавт. (1986, 1989). Они же разработали методику выделения в очи­щенном виде субъединиц фимбрии холерных вибрионов и определили N-концевую последовательность аминокислот.

Токсин-корегулирующий антиген пили (TCP) обнаружи­вался только в классических холерных вибрионах, выращен­ных в определенных условиях [Sharma D.P. et al., 1989].

По мнению P-Manning (1987), образование протективных антител вызывают белки наружной мембраны холерных виб­рионов, жгутиков и ЛПС, не вызывают — гемагглютинины.

Обширную группу термолабильных малоизученных антиге­нов представляют ферменты холерных вибрионов. В нашей лаборатории систематически ведется изучение иммуногенных свойств ферментов с целью использования их в качестве ком­

понентов вакцины. В экспериментах на морских свинках и кроликах было установлено, что ферменты холерных вибрио­нов — каталаза, муциназа [Адамов А.К. и др., 1977, Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Адамов А.К. и др., 1980; Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981], АТФ-аза [Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Майоров Н.В. и др., 1984], нейраминидаза, аль­долаза и фермент П ФЭП-зависимой глюкозотранспортной системы [Тихонов HT., Адамов А.К., 1981; Адамов А.К. и др., 1982, 1983] обладают слабой антигенностью.

В сыворотке животных, которым подкожно вводили с 7- дневным интервалом 640, 1280 и 2560 ед. муциназы или 11,6, 23,2 и 56,4 ед. протеазы, антитела к ферментам обнаружива­лись в титрах, равных 400—600 антиферментных единиц в 1 мл (АФЕ/мл). Токсического действия ферментов не отмеча­лось [Адамов А.К. и др., 1977; Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981].

Ферменты холерных вибрионов: АТФ-аза [Адамов А.К., Тихонов HT., 1977; Майоров Н.В. и др., 1984, 1987; Майоров Н.В., 1990], нейраминидаза, альдолаза и фермент П ФЭП- зависимой глюкозотранспортной системы [Адамов А.К. и др., 1982; Адамов А.К. и др., 1985] при подкожной иммунизации кроликов по схеме 0,15, 0,33 и 0,66 мг белка на 1 кг массы тела с 7-дневными интервалами между инъекциями вызывают накопление антиферментных антител в крови в титрах, не превышающих 10—30 АФЕ/мл.

При энтеральной иммунизации кроликов путем 6-кратного с 2-дневными интервалами введения холерной муциназы (3 введения в тонкую кишку по 1 мг муциназы и 3 — по 2 мг фермента) в тонкой кишке накапливались IgA-антитела в количестве, равном 1 АФЕ в 0,032 мг белка слизистой обо­лочки. В этих опытах была обнаружена новая функция антител класса IgA, заключающаяся в способности инактивировать ферменты [Адамов А.К. и др., 1980].

C целью повышения антигенности холерной АТФ-азы в качестве стимуляторов антителогенеза изучались полный адъ­ювант Фрейнда, дрожжевая РНК, вибрионная нейраминидаза и РНК-аза [Майоров Н.В., Адамов А.К., 1985; Майоров Н.В., 1988]. Ни одно из этих веществ не обладало стимулирующим действием на образование анти-АТФ-азных антител при им­мунизации кроликов АТФ-азой.

В пробирочных экспериментах антиферментные антитела против холерных ферментов: протеазы, муциназы, нейрами­нидазы, альдолазы, гексокиназы [Адамов А.К. и др., 1977; Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977], АТФ-азы [Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977], фермента П ФЭП-зависимой глюкозот­ранспортной системы [Адамов А.К. и др., 1982; Адамов А.К. и др., 1983] замедляли размножение холерных вибрионов; анти­тела против холерных ферментов протеазы и муциназы [Ада-

мов А.К. и др., 1977] ингибировали размножение холерных вибрионов только в среде с нативным белком. Они также обладали протективной активностью. Сыворотка против АТФ- азы холерного вибриона защищала лигированную петлю тон­кой кишки кролика от действия экзотоксина путем подавле­ния его синтеза в клетках вибрионов.

Холерная каталаза вызывала у животных синтез антител, которые, соединяясь с молекулами фермента, не ингибирова­ли их ферментной активности [Адамов А.К. и др., 1977].

Напряженный иммунитет к холере, согласно нашей гипо­тезе, может быть сформирован с помощью ферментов, вы­полняющих ключевые функции в транспортных звеньях или метаболических циклах вибрионов и доступных действию ан­тител.

J.P. Loventhal (1956), считая муциназу основным патогене­тическим фактором холерных вибрионов, предложил обога­щать убитую корпускулярную холерную вакцину препаратом холерной муциназы. Однако J.D.Gillmore и соавт. (1966) не подтвердили данных J.P.Lδventhal (1956) о более высокой им­муногенности холерной вакцины, обогащенной муциназой. У кроликов, иммунизированных холерной АТФ-азой [Адамов А.К. и др., 1973; Адамов А.К., 1980], холерной протеазой и ней­раминидазой [Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981], наблюдалось формирование антибактериальных и антитоксических механиз­мов защиты. При заражении в лигированные петли тонкой кишки кроликов, иммунизированных перечисленными выше ферментами, отмечались подавление размножения вибрионов в петлях кишки (в 2—7 раз) и снижение индекса наполнения петли кишки на 30—60 % по сравнению с контрольными интактными животными.

В вакцине «холероген-анатоксин ÷ О-антиген» содержатся ан­тигены некоторых ферментов, но в небольшом количестве, и они не вызывают образования антител [Джапаридзе М.Н. и др., 1974].

Холерная нейраминидаза при внутрибрюшинном введении белым мышам вызывала у них существенные изменения в форменных элементах крови [Сазыкин И.C., 1988]. Нейрами­нидаза в небольшом количестве содержится в вакцине «холе­роген-анатоксин ÷ О-антиген» [Джапаридзе М.Н. и др., 1978, 1980]. Посредством молекулярного клонирования гена холер­ной нейраминидазы на кишечной палочке получен штамм — продуцент нейраминидаз [Мишанькин Б.Н. и др., 1989].

Более высокой протективной активностью обладала анти­ферментная сыворотка, содержащая антитела к 3 ферментам холерных вибрионов. У пассивно иммунизированных живот­ных размножение вибрионов в лигированной петле тонкой кишки происходило медленнее в 6 раз и в 3,5 раза была снижена продукция экзотоксина.

По данным Р.В.Fernandes (1979), антитела против НАД-

гидролазы внутренней мембраны блокируют АДФ-рибозил- трансферазную активность холерного экзотоксина.

Важность антиферментных механизмов иммунитета была подтверждена RATinkelstein (1986) в экспериментах с белка­ми наружной мембраны холерного вибриона, регулирующими поступление необходимого для размножения вибриона железа путем переноса его с сидерофора в синтетические фермент­ные звенья вибрионов. RATinkelstein (1986) показал, что иммунные моноклональные антитела против этих белков дей­ствуют вибриоцидно на холерные вибрионы и бактериостати­чески на некоторые грамотрицательные бактерии.

Согласно сообщению R.S.Growther и соавт. (1987), а₂-мак- роглобулин ингибирует металлопротеиназу холерного ви­бриона.

Согласно сообщению D.R.Schneider и G.DTarker (1978), протеазадефицитные мутанты холерных вибрионов слабее колонизируют кишечник, чем полноценные штаммы холер­ных вибрионов. Следовательно, подавление протеазы антите­лами будет способствовать защите организма от заражения холерными вибрионами.

Динамику накопления ферментов в реакторных культурах холерных вибрионов изучали И.А.Кузьмиченко и соавт. (1988).

Холерный экзотоксин вызывает образование специфичес­ких антитоксинов и антитоксических механизмов иммунитета. Особенности образования экзотоксина в культурах относи­тельно хорошо изучены [Наумшина М.С., Адамов А.К., 1970, 1971; Зыкин Л.Ф. и др., 1970; Джапаридзе М.Н. и др., 1974; Оленичева Л.С. и др., 1989; Dodin А., 1978]. Молекула холер­ного экзотоксина состоит из 2 субъединиц — А (несущая активный центр токсина) и В (содержащая центр связывания с ганглиозидом).

Согласно сообщениям K.E.Heitmancikk и соавт. (1977) и P.В.Sigler и соавт. (1978), субъединица А кроме токсического центра содержит строго специфическую для нее антигенную детерминанту и общую антигенную детерминанту с цепью β субъединицы В [Адамов А.К., 1981]. Три типа антигенных детерминант в молекуле холерного экзотоксина обнаружили Y.Takeda и соавт. (1983).

C помощью моноклональных антител к холерному экзоток­сину М.L-TampIin и соавт. (1989) обнаружили, что в молекуле экзотоксина классического биовара холерных вибрионов эпи­топы более консервативны, чем в экзотоксине, продуцируе­мом вибрионами Эль-Тор. В субъединице В экзотоксина клас­сического биовара обнаруживались 5 уникальных эпитопов. В субъединице В холерного экзотоксина биовара Эль-Тор содер­жались эпитопы, сходные с эпитопами экзотоксина холерных вибрионов классического биовара, и уникальные, характер­ные только для экзотоксина биовара Эль-Тор. По данным

S.van Heningen (1976), сыворотка против субъединицы В не инактивирует субъединицу А, но блокирует патологическое действие целой молекулы экзотоксина.

Иммуногенность холерного анатоксина зависит от дозы. При введении в двенадцатиперстную кишку холерный анатоксин вызывает иммунологическую перестройку только после 2-крат­ного введения в дозах 1—2 мг [Pierce N.F., 1978]. В пересчете на человека разовая доза составляет примерно 0,5—1,4 г.

Поданным S-Migasena и соавт. (1989), высокой иммуноген­ностью обладал тепловой полимер холерного экзотоксина прохолерогеноид. Иммуногенность 100 мкг прохолерогеноида у людей соответствовала активности 1—5 мг субъединицы В. Доза 200 мкг прохолерогеноида вызывала у людей диарею.

При пероральном введении молекула экзотоксина и субъе­диница В вызывают клеточные реакции, различающиеся по некоторым показателям. Согласно сообщению N.Lycke и соавт. (1989), после многократных пероральных введений мышам холерного экзотоксина у них в кишечнике образуется боль­шое количество клеток, синтезирующих IgA-антитоксины, и вырабатывается устойчивость к действию токсина, вводимого в лигированные петли кишки. Многократное пероральное введение мышам субъединицы В вызывает образование не­большого количества клеток — продуцентов IgA-антитокси­нов в кишечнике, и формируется очень слабая устойчивость к токсину при введении его в лигированные петли кишки. Пероральное введение животным субъединицы В, смешанной с небольшим количеством холерного экзотоксина, стимули­ровало образование клеток — продуцентов антитоксинов только в проксимальном отделе тонкой кишки, что не обеспечивало выработку устойчивости к холерному токсину. Добавление большего количества холерного экзотоксина к субъединице В увеличивало накопление клеток — продуцентов IgA-антиток­синов в проксимальном и дистальном отделах тонкой кишки, а также способствовало повышению устойчивости к холерно­му экзотоксину при введении его в лигированные петли кишки.

Приведенные данные об изменчивости эпитопов холерного экзотоксина позволяют высказать предположение о влиянии ее на эффективность антитоксических механизмов, формиру­ющихся при введении экзотоксинов с разными по специфич­ности эпитопами, но этот вопрос еще не изучен.

По данным N.F.Pierce и соавт. (1988), антитоксины слабо влияют на освобождение кишечника животных от холерных вибрионов.

S.С.Sanyal и соавт. (1983) открыли новый холерный термо­лабильный экзотоксин, отличающийся от холерогена по ан­тигенной структуре. Новый токсин HXT (NCT) нейтрализует­ся сывороткой против неочищенного холерного экзотоксина штамма 569В. Для получения антисыворотки против HXT

используются штаммы классического холерного вибриона 2740- 80 (от человека), Х-392 и 1074-78 (из окружающей среды), лишенные гена XT (СТ-).

При исследовании 13 штаммов XT-ген негативных S.C.Sanyal и соавт. (1983, 1984) установили, что они синтезируют но­вый, еще неизвестный токсин, который вызывает в лигиро­ванной петле тонкой кишки взрослых кроликов аккумулиро­вание жидкости, в месте внутрикожного введения — увеличе­ние проницаемости сосудов, после перорального введения крольчатам — диарею. Новый холерный токсин незначительно отличался от XT токсина. В экспериментах с сыворотками против XT токсина и его субъединиц А и В S.С.Sanyal и соавт. (1984) не наблюдали нейтрализации ими HXT.

A. D.O’Brien и соавт. (1984) обнаружили в холерных вибри­онах шигаподобный цитотоксин. Они высказали предположе­ние об идентичности HXT и шигаподобного экзотоксина.

S.С.Sanyal (1989) показал, что нет иммунологической свя­зи у HXT и шигаподобного токсина. Более того, НХТ-проду- цирующие штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена XT, не имеют и механизма синтеза шигаподобного токсина. Штаммы холерных вибрионов классического биовара серова- ров Огава и Инаба, выделенные из испражнений больных, а также гипертоксический штамм холерного вибриона класси­ческого биовара 569В Инаба продуцируют и XT, и HXT [Sanyal S.C. et al., 1987; Saha S., Sanyal S.C., 1988]. При исследовании полуочищенного препарата HXT, полученного от ген-СТ- штамма Х-392 холерного вибриона 01 серовара, S.Saha и S.С.Sanyal (1989) установили, что по иммунобиологическим свойствам HXT идентичен XT. Авторы считают необходимым учитывать наличие двух систем синтеза холерного экзотоксина при конструировании вакцины. Приведенные данные о содер­жании гена vet получены с помощью метода J.В.Kaper и соавт. (1981). Посредством метода геномной дактилоскопии А.Л.Гин- цбург и соавт. (1989) показали, что все вирулентные штаммы содержат ген vet.

Согласно сообщению M.L.Tamplin и соавт. (1987), холер­ные вибрионы синтезируют ингибитор транспортного Na-κa- нала.

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости более глубокого изучения свойств холерных экзотоксинов. Заслуживает всестороннего изучения также свойство холерно­го экзотоксина усиливать (адъювантное действие) формиро­вание иммунитета слизистых оболочек [Елисеев Ю.Ю. и др., 1989; Svennerholm А.-М. et al., 1982; Mckenzic S.J., Halsey J.F., 1984; Liang X. et al., 1989; Czerkinsky С. et al., 1989; Szu Sh.С. et al., 1989].

Эксперименты на животных позволяют высказать предпо­ложение, что все вакцины, содержащие О-антигены холерных

вибрионов, формируют иммунные молекулярные циклы, со­стоящие из антител против структурных антигенов и фермен­тных звеньев клеток макроорганизма, которые высокоэффек­тивны у лиц с определенным обменом веществ. Из этой груп­пы циклов наиболее эффективны иммунный цикл, включаю­щий антитела против структурных антигенов холерных вибрионов, и ферменты гликолитического цикла энтероцитов животных. Этот цикл и, вероятно, цикл «антитела к структур­ным антигенам + ингибиторы ферментов гликолитического цикла» обеспечивают ингибирование гликолитического цикла вибрионов. Описанный антиферментный механизм местного иммунитета в сочетании с другими факторами у лиц с устой­чивым обменом веществ обеспечивает защиту от холерных вибрионов. Вероятно, среди населения указанные лица и со­ставляют те 60 %, которые оказываются защищенными при полевых испытаниях холерных вакцин.

Полную 100 % защиту, по-видимому, следует ожидать при формировании иммунных циклов, состоящих из антител про­тив ключевых ферментов метаболических звеньев холерных вибрионов, функционирующих кооперативно с ферментными звеньями и рецепторами энтероцитов.

ХОЛЕРНЫЕ ВАКЦИНЫ

Разработки холерной вакцины, интенсивно проводившие­ся в 1970—1980 гг., не увенчались успехом, несмотря на ис­пользование разных принципов конструирования: живая вак­цина, убитая цельноклеточная вакцина (корпускулярная), молекулярная (химическая), ферментная, комплексная (цель­ноклеточная убитая, обогащенная очищенными антигенами, синтетическая и искусственноклеточная) [Адамов А.К., 1980; Адамов А.К. и др., 1984, 1988]. По-видимому, этим обстоя­тельством объясняется продолжающееся и в настоящее время использование уже достаточно изученных ранее вариантов состава вакцин наряду с поисками принципиально новых технологических решений.

Живые вакцины относятся к вакцинам первого поколения, принципы разработки которых были заложены Л.Пастером. Первая живая холерная вакцина представляла собою жидкую культуру холерных вибрионов с искусственно сниженной при ее выращивании вирулентностью. В последующие годы подоб­ные вакцины разрабатывались Д.К.Заболотным (1893), В.Хав­киным (1906) и Н.К.Верениновой и соавт. (1958—1959) в институте «Микроб». Несколько лет спустя S-Mukerjee (1963) выделил из объектов окружающей среды авирулентные штам­мы холерных вибрионов, которые рекомендовал использовать в качестве живой вакцины.

В институте «Микроб» из штамма Эль-Тор серовара Инаба был селекционирован авирулентный штамм 118В серовара Инаба, который в опытах на животных проявлял высокую иммуногенность, особенно в смеси со штаммом GW-6 [Пет­рова Л.С. и др., 1972; Адамов А.К. и др., 1973; Адамов А.К. и др., 1983; Шмеркевич Д.Л. и др., 1985].

В опытах на животных были получены авирулентные и иммуногенные штаммы холерных вибрионов [Joo J., 1974; Finkelstein R.A. et al., 1974—1982; Honda J., Finkelstein R.A. 1982]. Вакцинный штамм T.Honda и R.A.Finkelstein (1979), названный ими “Звезда Техаса”, относится к биовару Эль- Тор серовара Огава. Он продуцирует в достаточно большом количестве не экзотоксин, а его нетоксичную субъединицу В. Тем не менее у 20 % добровольцев этот штамм вызывает диарею [Levin М.М. et al., 1981, 1984].

Исследования штаммов, выделенных из кишечника чело­века, окружающей среды или полученных с помощью генети­ческих приемов холерных вибрионов Ol серовара [Kaper J.B., Levin М.М., 1981; Levin М.М. et al., 1982; Mekalanos J.J. et al., 1982], которые не содержали гена холерного экзотоксина (ХТ-), показало, что у ¹∕3 привитых ими перорально людей развивается диарея [Levin М.М., 1986]. J.В.Kaper и соавт. (1984, 1989), М.М.Levin и соавт. (1988, 1988а) с помощью рекомби­нантной генноинженерной технологии получили вакцинный штамм холерного вибриона CVD ІОЗ-HgR, синтезирующий субъединицу В холерного экзотоксина, который при перо­ральной иммунизации людей [Migasena et al., 1989] вызывал накопление антител в крови. Разрабатываются и другие ре­комбинантные вакцины [Мотин В.Л. и др., 1988; Смирнова Н.И. и др., 1988, 1989; Imamoto T., 1988; Dougan G. et al., 1988; Stelszner A. et al., 1989].

Согласно данным N.F.Pierce и соавт. (1984—1987), иммуно­генность штаммов холерных вибрионов не связана с наличием в клетках A⁺и B⁺генов vet. Она обусловлена способностью штаммов адгезироваться к энтероцитам и приживаться в ки­шечнике. Тем не менее подвижность муциназы и токсина, вероятно, способствует адгезии штаммов вибрионов к энтеро­цитам [Асташкин Е.И. и др., 1985; Pierce N.F. et al., 1985, и др.]. По данным Р.А.M-Guinee и соавт. (1987), напряженный иммунитет к холерным вибрионам при пероральной иммуни­зации вызывают только вакцинные штаммы, имеющие в клет­ках A⁺и B⁺гены vet.

H.Fujisawa и соавт. (1987) в сравнительных опытах на мы­шатах-сосунках линии BALBC установили, что при перораль­ном введении живые холерные вибрионы вызывают более напряженный иммунитет, чем убитые нагреванием вибрионы. Очищение мышей от вибрионов после повторного заражения происходило быстрее у иммунизированных живыми вибрио­

нами животных, чем у иммунизированных убитыми вибрио­нами.

По наблюдениям N.RPierce и соавт. (1988), иммуноген­ность живых вакцин зависит в основном от свойства колони­зировать кишечник. Вакцины, слабо приживающиеся в ки­шечнике, не иммуногенны.

Используя методы генной инженерии, Джакоб (1988) ввел в авирулентный штамм сальмонеллы ген СТР-3, кодирующий синтез фрагмента СТР50—60 субъединицы В холерного экзо­токсина. В гибридном штамме ген экспрессировался в виде гибрида с флагеллином. В.DTorrest и соавт. (1989) получили гибридную холерную живую вакцину EX 645 путем введения в авирулентный штамм S.typhi гена 21а, контролирующего синтез О-антигена холерного вибриона. При пероральном введении добровольцам эта вакцина вызывала иммунологи­ческую перестройку, сопровождавшуюся накоплением в кро­ви специфических антител. По данным C.O.Tacket и соавт. (1990), вакцина вызывала у добровольцев образование имму­нитета, обеспечивающего защиту только 25 % привитых, но авторы считают ее перспективной. Q.-I.Ma и соавт. (1990) с помощью рекомбинантной плазмиды рММ-СТВ, несущей ген субъединицы В холерного экзотоксина, получил штамм Ту 21а (рММ-СТВ), продуцирующий субъединицу В. На основе это­го штамма они сконструировали вакцину, состоящую из кле­ток Ту 21а (рММ-СТВ) и убитых клеток вибрионов, которая обладала иммуногенностью.

Вакцинные штаммы холерных вибрионов, полученные раз­ными способами, не применяются в медицинской практике вследствие токсигенности их для людей, опасности полной реверсии вирулентности и недостаточной иммуногенности.

К вакцинам второго поколения относятся убитые корпус­кулярные вакцины, комплексные вакцины, молекулярные вакцины (химические вакцины). Основы конструирования этих вакцин заложены Н.Ф.Гамалея (1888) и W.Kolle (1896). Со­вершенствование вакцин второго поколения не увенчалось значительными успехами, но позволило создать убитые кор­пускулярные холерные вакцины, широко применявшиеся в практике и обеспечивающие 50—60 % защиту [Олли В.Д., Петрова Л.C., 1960; Караева Л.Т. и др., 1966, 1968; Лавровская

В.М., 1969; Joo J., 1974].

Холерную ассоциированную вакцину, состоящую из уби­тых клеток вибрионов и живой чумной вакцины, разработали Е.И.Коробкова и соавт. (1958).

Л.Т. Караева и соавт. (1971) для повышения иммуногенности убитой корпускулярной холерной вакцины предложили добав­лять в нее очищенный антиген Ватанабе. Более иммуногенной в опытах на животных оказалась вакцина, ассоциированная с вакциной брюшного тифа [Караева Л.Т. и др., 1975—1979].

Для парентерального применения J.S.Saroso и соавт. (1978), JJoo и Z.Csizer (1978) разработали вакцину, состоящую из убитых клеток холерных вибрионов, сорбированных на гидро­окиси аммония. В полевых условиях эта вакцина у детей до 5 лет обеспечивала в течение 6 мес IOO % защиту, через 12 мес после прививки — 88,9 %, у взрослых через 6 мес — 60 % [Pal S.C. et al., 1980].

Ciufecu и соавт. (1980) разработали для внутрикожной иммунизации новую корпускулярную вакцину, содержащую убитые нагреванием клетки холерных вибрионов.

Убитую корпускулярную вакцину, состоявшую из клеток вибрионов холерного токсоида, для подкожной иммунизации в 1973—1987 гг. разработали А.К.Адамов и соавт. (1990). Вакци­на обладала высокой иммуногенностью. Эти данные были подтверждены I.W.Peterson (1979).

Убитые корпускулярные вакцины при парентеральном вве­дении вызывали накопление в крови агглютининов, вибрио- цидинов и антигемолизинов, а также секреторных антител в кишечном секрете и слюне [Адамов А.К., 1980; Hohu-Zoric М. et al., 1989].

Вакцина для перорального применения, содержавшая уби­тые клетки холерных вибрионов 3 штаммов и холероген-ана- токсин, была предложена А.К.Адамовым и А.И.Волосивец (1973) и широко испытана на животных и добровольцах. Эксперименты на кроликах показали, что после внутрижелу- дочного введения этой вакцины у них возникал иммунитет, защищавший от заражения холерными вибрионами в лигиро­ванные петли тонкой кишки [Адамов А.К. и др., 1973, 1983, 1991; Волосивец А.И. и др., 1976; Волосивец А.И., Адамов А.К., 1979].

Вакцины, состоявшие из убитых клеток холерных вибрио­нов и токсоида, разрабатывались J.W.Peterson (1979), Z.Kudelski и A.Zahraewska (1986).

В Советском Союзе для производства холерного анатоксина и химических вакцин использовался штамм V.cholerae Cholerae 569В серовара Инаба линии “НА”, продуцирующий большое количество экзотоксина в простой среде, содержащей гидро­лизат казеина и пептон. Этот штамм М.С.Наумшина и А.К.­Адамов (1969) селекционировали из штамма V.cholerae cholerae 569В серовара Инаба, широко применяемого за рубежом в качестве продуцента экзотоксина. В последние годы найдены штаммы — продуценты экзотоксина среди диких штаммов [Авроров В.П. и др., 1987; Смирнова Н.И. и др., 1989, 1990] и получены с помощью генной инженерии штаммы — про­дуценты холерного экзотоксина [Смирнова Н.И. и др., 1989] и штаммы — продуценты субъединицы В [Honda T., Finkelstein R.A., 1979; Sanchez J., Holmgren J., 1989, и др.].

C целью повышения иммунной эффективности холерных

вакцин предлагались комбинированные парентерально-энте­ральные способы иммунизации [Адамов А.К. и др., 1974; Denchev V. et al., 1974; Peterson J.W., 1979, и др.].

J-Holmgren и A.N.Svennerholm (1983) предложили вакци­ну, состоящую из убитых клеток вибрионов и субъединицы В холерного токсина. В течение последующих лет авторы изучи­ли ее эффективность в лабораторных условиях и полевых испытаниях [Black В.Е. et al., 1987; Gertborn М. et al., 1984— 1988; Glemens J.D. et al., 1986—1989; Migasena М. et al., 1989]. По данным M-Migasena и соавт. (1989), вакцина, состоявшая из 2-1011 убитых клеток вибрионов и 5 мг субъединицы В, была более иммуногенна, чем вакцина, содержащая меньшее количество компонентов. J.D.Clemens и соавт. (1990) проводи­ли полевые испытания вакцины, состоявшей из убитых виб­рионов и субъединицы В. Защита от заболевания холерой не превышала 60 %.

Химическая вакцина, возможность конструирования кото­рой впервые показана Н.Ф.Гамалеей (1888), была разработана Н.Е.Гефен (1943). Вакцина применялась для профилактичес­кой иммунизации населения, но вследствие недостаточной иммуногенности производство ее прекратили [Крестовнико- ва В.А., 1956].

После подтверждения данных И.И.Мечникова о существо­вании холерного экзотоксина [De S.N. et al., 1959; Dutta N.K. et al., 1959], обнаружения штамма — продуцента экзотоксина и разработки методики получения анатоксина [Craig J.P., 1966; Sack R. et al., 1966; Saletti M., Ricci А., 1974, и др.] большин­ство исследователей считали, что проблема конструирования вакцин будет решена в ближайшие годы путем получения высокоочищенного холерного анатоксина [Finkelstein R.A., 1965, 1970; Burrows W. et al., 1971; Holmgren J. et al., 1972]. В экспериментах на животных некоторыми исследователями были получены обнадеживающие результаты [Craig J.P., 1966; Burrows W. et al., 1971; Fudjita K., Finkelstein R.A., 1972, и др.]. Тем не менее более четко поставленные эксперименты на животных [Адамов А.К. и др., 1969—1973; Srivastava R. et al., 1979], а также наблюдения на добровольцах [Homick R.B. et al., 1972; Gash R. et al., 1974; Levine М.М. et al., 1979] и полевые испытания [Комитет экспертов ВОЗ, 1979—1980; Finkelstein R.A., 1979] показали, что химическая вакцина, содержащая холероген-анатоксин, не вызывает эффективного иммунитета к холере.

Впервые химическую холерную вакцину для парентераль­ного введения, состоящую из анатоксина, О-антигенов Инаба и Огава, разработали М.Н. Джапаридзе и соавт. (1972, 1974). Вакцина после комиссионных испытаний была внедрена в практику здравоохранения СССР, но противоэпидемическая эффективность ее не изучена [Джапаридзе М.Н. и др., 1974—

1985; Сумароков А.А. и др., 1974—1978; Караева Л.T., 1977, 1978].

Технология производства вакцин постоянно совершенству­ется [Эмдина И.А. и др., 1987; Владимцева И.В. и др., 1988; Алексеева А.Л. и др., 1988; Бурлакова О.С. и др., 1989; Сла­вянская Т.А. и др., 1989; Лобанов В.В. и др., 1988; Ненецкая Р.М. и др., 1988; Мелещенко М.В., Джапаридзе М.Н., 1989; Щуковская Т.Н. и др., 1989; Ермакова Г.В. и др., 1989; Кос­тина Г.И. и др., 1989].

Н.Е.Гефен и соавт. (1970, 1972), Е.Липкин и соавт. (1970) в качестве холерной вакцины предложили смесь холерного экзотоксина с О-антигенами, сорбированными на трехзаме­щенном фосфате кальция. Препарат обладал недостаточной иммуногенностью.

Холерную химическую вакцину для перорального приме­нения впервые разработали В.Н.Космодамианский и А.И.Бе­лоусова (1925).

Химическую вакцину для пероральной иммунизации на основе холерного анатоксина разрабатывали В.В.Лобанов и

С.М.Рассудов (1973), М.Н.Джапаридзе и соавт. (1976), N.F.Pierce и соавт. (1983). Завершаются испытания таблетиро­ванной холерной химической вакцины для перорального при­менения [Джапаридзе М.Н. и др., 1979—1990].

Г.И.Костина и М.В.Сидорова (1987) разрабатывают перо­ральную холерную вакцину на основе субъединицы В токсина.

Ю.Г.Резник и соавт. (1980) показали, что препарат, состо­ящий из смеси неочищенных компонентов жгутиков холерных вибрионов и анатоксина, вызывает напряженный иммунитет, обеспечивающий защиту животных при заражении их в лиги­рованные петли тонкой кишки.

По данным Р.Б.Манахилова и соавт. (1986), эффективность иммунизации химической вакциной возрастает при комбини­рованном подкожно-пероральном ее применении.

Под руководством Додена (1978—1980) во Франции разра­батывалась химическая таблетированная вакцина, представля­ющая собой фрагменты наружной мембраны клеток холерных вибрионов, экстрагируемые трихлоруксусной кислотой, или посредством колоночной хроматографии, или с помощью ультрафильтрации. Эта вакцина была испытана в Заире в 1983— 1984 гг. с положительным результатом: из 12 014 привитых людей заболели холерой 6 человек (0,05 %), в то время как в контрольных группах из 6249 привитых парентерально лю­дей заболели 57 человек (0,91 %) и из 18 377 получивших плацебо — 216 человек (1,17 %). Авторы отмечают, что это предварительные данные [Masengo В., 1984].

Вакцины третьего поколения — синтетические вакцины, основанные на использовании антигенных фрагментов, со­держащих только антигенные детерминанты, начали разраба­

тывать зарубежные [Carlson Н.Е. et al., 1977; Svenson S.В. et al. 1977, 1979; Audibert R et al., 1981, 1981а, 1982; Bulinski J.Ch., 1983, 1986] и советские исследователи [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1978; Кабанов В.А., 1987].

Антигенные фрагменты могут быть выделены из нативных молекул возбудителей инфекций [Свенсон и др., 1977—1981; Кабанов, 1984] или синтезированы искусственно [Села М. и др., 1984; Carlson Н.Е. et al., 1977; Audibert F. et al., 1981, 1981а; Jacob Ch.О. et al., 1983]. Как правило, они иммуногенны с адъювантами. Показана возможность использования в качестве адъювантов фрагментов, выделенных из нативных молекул микобактерий, полных антигенов сальмонелл [Adam A. et al., 1976] и синтетических веществ [Кабанов В.А., 1984; Села M., 1984; Свиридов Б.Д. и др., 1986; Merger С. et al., 1975].

S.B.Svenson и соавт. (1979) установили, что из очищенных препаратов порина сальмонелл и октасахарида сальмонелл с помощью химических методов могут быть получены крупно­молекулярные полимеры, обладающие иммуногенностью.

С.OJacob и соавт. (1983) синтезировали небольшие пепти­ды: CTP8-20; СТРЗО-42; CTP69-85; CTP75-85; СТР50-64; СТР83-97, соответствующие определенным участкам пептид­ной цепи субъединицы В холерного экзотоксина. Этими пеп­тидами, ковалентно связанными с молекулами тетанотоксина (в качестве носителей), иммунизировали животных. Сыворот­ка против пептида СТР50—60 нейтрализовала холерный экзо­токсин в кожной пробе и в лигированной петле тонкой киш­ки кролика [Jacob С.О. et al., 1983, 1986, 1988; Pedoussant S. et al., 1989].

Разработка синтетической холерной вакцины, несомнен­но, актуальна. Исследования в этом направлении только на­чаты как в России, так и в зарубежных лабораториях.

Вакцины четвертого поколения — искусственноклеточные вакцины, научно обоснованные А.К.Адамовым (1975), пред­ставляют собою искусственные капсулы или протопластопо­добные частицы на синтетических или биологических полиме­рах, содержащие структурные антигены, анатоксины, фер­менты и адъюванты в оптимальных соотношениях. В качестве антигенов при производстве искусственноклеточных вакцин могут использоваться синтетические вакцины. Искусственно­клеточные вакцины лишены недостатков, имеющихся у жи­вых вакцин, и обладают преимуществами живых и искус­ственных вакцин. В экспериментах было установлено, что ис­кусственные клетки, содержащие структурные антигены и фер­менты, более иммуногенны, чем эти же компоненты, вводимые животным в виде раствора, так как искусственная клетка действует на клетку иммунной системы макроорганизма одно­временно комплексом разных антигенов, имитируя действие патогенного микроба.

При конструировании искусственноклеточных вакцин воз­можно применение следующих способов: 1) заключение ан­тигенов и ферментов в искусственные протопласты, форми­руемые путем коацервации или полимеризации из природных или синтетических полимеров; 2) микрокапсулирование с использованием природных или синтетических полимеров; 3) микрокапсулирование с образованием липосом, содержа­щих антигены и ферменты [Адамов А.К., 1975, 1981; Ост­ро М.Д., 1987; Richards R.L. et al., 1980].

Для приготовления искусственных клеток предложены раз­личные композиции, включающие дезоксихолат, липид и некоторые другие комплексы [Herman S.H., Mescher М.Е., 1981]; поли-2-гидроксиэтилметакрилат [Торчилин В.П., Смир­нов С.П., 1984; Ronel S.H. et al.,1983, и др.]; лектин и холе­стерин [Mateligia T.M., Motas C., 1986]; полиакриловый крах­мал и некоторые другие компоненты [Arturson P. et al., 1986]. Введение в искусственные клетки некоторых ферментов адре­сует их в определенные ткани организма [Ротман Д.Э., 1985].

А.К. Адамов и Н.Г. Тихонов (1974) показали, что искусст­венноклеточные препараты, представляющие собой холерный 0-антиген, заключенный в желатиновые протопласты, обла­дают более высокой иммуногенностью, чем растворимые ан­тигены. Согласно сообщениям N.F. Pierce и соавт. (1984), Н.И. Нарбутович и соавт. (1985), холерный экзотоксин в ли­посомах более иммуногенен, чем в растворенном состоянии.

Искусственноклеточные вакцины находятся в начальной стадии разработок. Полученные результаты исследований по­зволяют признать конструирование искусственноклеточной вак­цины главным направлением в разработке холерных вакцин.

Еще по теме ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ХОЛЕРЫ:

1. Иммунопрофилактика
2. Иммунопрофилактика массовых инфекционных заболеваний
3. Пассивная иммунопрофилактика И ИММУНОТЕРАПИЯ
4. Средства иммунопрофилактики
5. Глава 21. Иммунопрофилактика
6. Активная иммунопрофилактика И ИММУНОТЕРАПИЯ
7. Иммунопрофилактика личного состава по эпидемическим показаниям
8. Достижения иммунопрофилактики
9. Проблемы иммунопрофилактики
10. Порядок проведения иммунопрофилактики
11. Сочетанное проведение экстренной профилактики и иммунопрофилактики в очаге биологического заражения
12. Холера у детей