ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данная работа выполнена в лаборатории экспериментальной терапии опухолей Ростовского научно-исследовательского онкологического института, в опытах использовано 802 крысы и опухолевый материал от 42 больных.

На первом этапе работы проводилось изучение механизма противоопухолевого действия переменного магнитного поля (100 Гц 50 мТл) с использованием модели ксенографтов злокачественных опухолей человека, культивируемых в диффузионных камерах (ДК) в брюшной полости крыс. Этот метод сравнительно прост, требует незначительного количества исследуемого материала и вместе с тем позволяет оценить степень злокачественности опухолей различных локализаций и гистологического строения и их чувствительность к тем или иным лечебным воздействиям (Барановский М.А. и соавт., 1990; Сергеева Н.С. и соавт., 1990; Петрова А.С., 1993; Сидоренко Ю.С., 1998).

В этом исследовании были использованы только нелеченные бла- стомы. Стерильным скальпелем в операционной иссекали 1-2 кусочка опухолевой ткани без кровоизлияний и некрозов, размером 0,5x1x1 см, помещали в стерильный флакон с питательной средой Игла с добавлением антибиотиков (по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл) и в закрытом виде доставляли в лабораторию. Все дальнейшие работы производили в стерильных условиях бокса. Опухолевый материал измельчали механическим путем (глазными ножницами и гомогенизатором), в камере Горяева определяли клеточность полученной взвеси и далее опухолевые клетки располагали в диффузионные камеры по 500-800 тысяч в каждую (Барабой В.А. и соавт., 1990; Колесникова А.И. и соавт., 1995).

Диффузионные камеры представляют собой парные пластмассовые кольца с наклеенными на них миллипоровыми фильтрами «СЫНПОР» (Чехия). Фильтры изготовлены из очищенных эфиров целлюлозы - материала биологически инертного и не вызывающего токсических реакций со стороны клеток. Около 84% поверхности фильтров приходится на поры, размер пор — 0,23 мкм.

Далее ДК с опухолевыми клетками под эфирным наркозом имплантировали в брюшную полость белых беспородных крыс, по 3 камеры на животное.

Преимущество данного способа культивирования в том, что жизнедеятельность опухолевых клеток протекает в условиях целостного организма, с которым они сохраняют связь и осуществляют обмен веществ через стенку пористой мембраны. Иммунекомпетентные клетки реципиента не способны пройти через поры фильтров ДК, в то же время клетки злокачественной опухоли не защищены от воздействия гуморальных факторов иммунитета (Сергеева Н.С. и соавт., 1990; Сидоренко Ю.С., 1998).

В 1-2-е сутки культивирования происходит адаптация злокачественных клеток к новым условиям существования и размножения их не наблюдается, затем в течение 7-10 дней число клеток в ДК постоянно нарастает, а позже начинается гибель ткани. В связи с этим продолжительность опытов не превышала 7 дней (Барабой В.А. и соавт., 1990; Барановский М.А. и соавт., 1990). В данных опытах использовано 1134 ДК, 378 крыс и опухолевый материал от 42 больных РНИОИ.

При исследовании противоопухолевого действия переменного магнитного поля (ПеМП) в качестве ксенотрансплантатов использовали рак легкого (от 7 больных), рак молочной железы (7 больных), опухоли яичников (7 больных), опухоли головного мозга (7 больных), опухоли губы

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ₄₁ БИБЛИОТЕКА

(7 больных) и меланому (7 больных), которые выращивали в ДК в брюшной полости крыс. Животные с ДК были разделены на три группы: 1-я - контроль без воздействий; 2-я - воздействие ПеМП в течение 20 мин.; 3-я - воздействие ПеМП в течение 40 мин. Для омагничивания животных помещали по одному в плексигласовые боксы, которые располагали между круглыми магнитоиндукторами с диаметром рабочей поверхности 12 см.

Магнитоиндуктор

Рис. 2.1. Расположение бокса с животным между магнитоиндукторами.

где

’ крови

ТЭК - терапевтически эквивалентные концентрации химиопрепаратов для in vitro тестов; Д_еут. - суточная доза препарата (мг/кг веса); Укрови - объем крови (5000 мл). (Кулиляк О. А., 1993).

При исследовании действия ПеМП пластмассовые пробирки с опухолевыми клетками располагали между магнитоиндукторами аппарата «Градиент-1». По окончании опыта асцитную жидкость из каждой пробирки стеклянной палочкой наносили на предметные стекла, фиксировали 70° этанолом, окрашивали АО, определяли с помощью ЛЮМАМ-ИЗ параметр а.

Поставлен ряд опытов по изучению in vitro синтетической активности клеток лимфы больных раком яичников при действии ПеМП, доксору- бицина и его сочетания с рихлокаином и эпиталамином. Лимфа была взята от 7 больных гинекологического отделения РНИОИ и каждый образец был разделен на 5 видов проб:

1) контроль без воздействий;

2) воздействие ПеМП (100 Гц, 50 мТл) в течение 20 мин;

3) инкубация в термостате при 37°С с доксорубицином (0,05 мг/мл) в течение 30 мин.;

4) инкубация с эпиталамином (0,05 мг/мл) 30 мин. при 37°С, затем с доксорубицином 30 мин. при 37°С;

5) инкубация с рихлокаином (0,5 мг/мл) 30 мин. при 37°С, затем с доксорубицином (0,05 мг/мл) 30 мин. при 37°С.

После воздействий из каждой пробирки сделаны мазки лимфы, зафиксированы, окрашены, исследованы на люминесцентном микроскопе.

Третьим этапом нашей работы было изучение влияния нетрадиционных методов лечения на костномозговое кроветворение экспериментальных животных.

Для получения костного мозга после декапитации животных производится экзартикуляция бедренных костей на месте коленных и тазобедренных суставов. Бедренная кость осторожно освобождается от мягких тканей. Затем с помощью шприца через инъекционную иглу вымывается костномозговая ткань в направлении от дистального к проксимальному концу бедренной кости физиологическим раствором (10 мл) с добавлением гепарина 1— 1,5 ME или 0,2 мл лимоннокислого натрия. Далее на предметных стеклах делаются мазки костного мозга и высушиваются при комнатной температуре. Окрашивание препаратов производится по Паппенгейму-Крюкову (фиксатором-красителем Май-Грюнвальда и краской Романовского-Гимзы), после чего подсчитывают количество костномозговых клеток различных ростков кроветворения, в каждом препарате просматривая 500 клеток (5-6 полей зрения), определяют их процентное содержание, составляют миелограмму (Линднер Д.П. и соавт., 1993; Первушин Ю.В. и соавт., 1994; Шабаева М.М. и соавт., 1995; Солдаткина Н.В., 2000; Канаев С.В., 2001).

Опыты по изучению костномозгового кроветворения при нетрадиционных методах лечения проводили в осенне-зимний период на 291 самце белых крыс весом 180-220 г. (192 животных без опухоли и 99 крыс с С-45).

Для исследования действия ПеМП (100 Гц 50 мТл) на клеточный состав костного мозга животных разделили на 4 группы по 10 шт.: 1-я - крысы без опухоли и воздействий, 2-я - крысы без опухоли с воздействием ПеМП, 3-я - крысы с С-45 без воздействий, 4-я — крысы с С-45 с воздействием ПеМП. Магнитное воздействие проводили по 20 мин. ежедневно в течение 5 дней. На 6-й день животных декапитировали, мазки костного мозга, красили по Паппенгейму-Крюкову, проводили дифференциальный подсчет клеток, составляли миелограмму.

Влияние аутогемохимиотерапии на клеточный состав костного мозга изучали также на интактных и опухолевых (саркома 45) животных.

При исследовании различных способов введения доксорубицина на гемопоэз использовали 31 крысу без опухоли и 24 крысы с С-45.

Для изучения костномозгового кроветворения при различных способах введения циклофосфана использовали 31 интактную и 31 опухолевую крысу, которых разделили на 4 группы: 1-я - контроль, без воздействий (10 крыс); 2-я - циклофосфан внутрибрюшинно (7 крыс); 3-я - цик- лофосфан внутривенно (7 крыс); 4-я - циклофосфан внутривенно на аутокрови (7 крыс). Химиопрепарат вводили дважды с интервалом 3 дня, суммарная доза препарата — 100 мг/кг. АГХТ проводили по стандартной методике. На 3-й день после последнего введения циклофосфана животных декапитировали, мазки костного мозга окрашивали по Паппенгейму- Крюкову и определяли процентное содержание различных видов клеток.

Влияние способов введения винкристина изучали на интактных крысах (41 животное), которых разделили на 4 группы: 1-я - контроль без воздействий (10 крыс); 2-я - винкристин внутривенно (7 крыс); 3-я - внутривенно винкристин на аутокрови (12 крыс); 4-я - внутривенно омагниченную с винкристином аутокровь (12 крыс). Химиопрепарат вводили дважды с интервалом 3 дня, суммарная доза препарата - 0,005 мг/кг. АГХТ и АГХМТ проводили по стандартной методике. На 3-й день после последнего введе- ния препарата животных декапитировали, окрашивали мазки костного мозга и подсчитывали миелограмму.

При изучении влияния нетрадиционных способов введения нейпо- гена на клеточный состав костного мозга использовали 38 интактных крыс, которых разделили на 5 групп: 1-я - контроль без воздействий (10 животных); 2-я - нейпоген внутривенно на 5% растворе глюкозы (7 крыс); 3-я — внутривенно нейпоген на аутокрови (7 крыс); 4-я - внутривенно нейпоген, омагниченный с аутокровью (7 крыс); 5-я - интрамедуллярное (в костный мозг бедренной кости) введение нейпогена (7 крыс).

Для исследования возможности применения в процессе химиотерапии местного анестетика рихлокаина 24 крысы с С-45 разделяли на 3 группы: 1-я — контроль без воздействий (10 животных); 2-я — введение доксорубицина внутривенно в дозе 6,7 мг/кг; 3-я - введение рихлокаина внутривенно (5 мг/кг), а через 20 мин. - доксорубицина внутривенно (6,7 мг/кг). На 3 день после введения препаратов животных декапитировали, мазки костного мозга окрашивали и составляли миелограмму.

Для изучения возможности применения в процессе химиотерапии кардиотоника суфана (Гриневич А.И., 1994) опыты были поставлены на 31 интактной крысе, которые были разделены на 4 группы: 1-я - контроль без воздействий (10 крыс); 2-я - циклофосфан внутрибрюшинно (7 крыс); 3-я - суфан внутривенно (7 крыс), 4-я - циклофосфан внутрибрюшинно + суфан внутривенно (7 крыс). Препараты вводили дважды с интервалом 3

дня. Суммарная доза циклофосфана составляла 100 мг/кг, суфана - 0,25 мг/кг. На 3-й день после последнего введения препаратов животных дека- питировали, мазки костного мозга окрашивали по Паппенгейму- Крюкову, подсчитывали процентное содержание всех видов клеток и костномозговые индексы.

Статистическую обработку полученных в ходе исследований результатов проводили с помощью критерия t Стьюдента. Различия считали достоверными при р