Приготовление сывороток и растворов для иммунолюминесцентной окраски

Рабочее разведение для видоспецифической (промежуточной) сыворотки, применяемой на 1 этапе окраски определяют путем ее титрования начиная с 1:5, затем 1:10, 1:20, 1:40 с люминесцирующей сывороткой.

Сухую люминесцирующую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды (ДВ). После растворения сыворотку центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин для удаления нерастворившихся частиц, осадок отбрасывают. Определяют красящий титр сыворотки. За него принимают то максимальное разведение, которое еще обеспечивает люминесцентное свечение положительного препарата с яркостью /++++/ или /+++/. Рабочее разведение люминесцирующей сыворотки в 2 раза меньше красящего титра. Разведенную сыворотку можно хранить при температуре +2^о…+6^оС в течение 2 недель.

Альбумин бычий, меченный родамином С растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме ДВ. После растворения препарат центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин для удаления нерастворившихся частиц, осадок отбрасывают. Для окрашивания проб используют разведенный в 2-4 раза препарат.

Для приготовления забуференного физиологического раствора (ЗФР), используют одно- и двухзамещенные соли фосфорнокислого натрия или калия. Предпочтительнее использовать соли фосфорнокислого натрия. Готовят 1 М растворы. Для этого берут 142 г Na₂HPO₄ на 1 литр ДВ и 120 г NaH₂PO₄ на 1 литр ДВ воды (или, соответственно, 174 г K₂HPO₄ и 136 г KH₂PO₄). Затем растворы смешивают 1:1, доводят pH до 8,0 (одним или другим раствором), вносят азид натрия или другой консервант в концентрации 1:10000. Забуференный физиологический раствор – это 1 литр физиологического раствора (0,15 M или 8,5 г NaCl на 1 литр воды), к которому добавлено 10 мл натрий-фосфатного или калий-фосфатного 1 М буферного раствора.

1 М натрий-фосфатный и калий-фосфатный буферные растворы длительно хранятся при температуре +2^о…+6^оС.