Иммунолюминесцентное окрашивание

При дифференциации возбудителя туберкулеза от атипичных микобактерий применяется непрямой метод иммунолюминесцентной микроскопии с использованием кроличьей видоспецифической антисыворотки к M.

Мазки, окрашенные флуорохромными красителями, просматривают под значительно меньшим увеличением (обычно 250х или 630х), чем увеличение, используемое для просмотра мазков, окрашенных по Циль-Нильсену (световая микроскопия). В силу этого поле зрения, просматриваемое под люминесцентным микроскопом, имеет большую площадь, чем поле зрения светового микроскопа.

1. Порядок люминесцентной окраски.

1.1 Подготовка ингредиентов для окрашивания.

Собранный в стерильную посуду патологический материал подвергают механической и химической обработке, предусмотренной для его подготовки. Для иммунолюминесцентного исследования отбирают часть осадка и вносят его в объеме 0,1 - 0,2 мл в стерильные пробирки типа «Эппендорф» объемом 1 мл (pH суспензии должен бать в пределах 6,3-6,5) или делают мазки на чистых обезжиренных предметных стеклах.

Бактериальные культуры, предназначенные для изготовления мазков (контроль), выращивают на жидких или плотных питательных средах. При этом срок их культивирования на жидких средах не должен превышать 7-10 суток (в зависимости от характера роста). На 7-10 сутки конгломерат культуральной пленки со среды Сотона, взвешенные колонии со среды Школьниковой или колонии с плотных питательных сред переносят в объеме 0,1 - 0,2 мл (суспензию плотных колоний готовят на забуференном физиологическом растворе, pH 7,2-7,4) в стерильные пробирки типа «Эппендорф» объемом 1 мл, или делают мазки на чистых обезжиренных предметных стеклах. Мазки высушивают и фиксируют этанолом в течение 40 мин.

Из ксилольного кольца материала, концентрированного методом флотации (см. выше), отбирают 0,1 – 0,2 мл и вносят в стерильные пробирки типа «Эппендорф» объемом 1 мл или делают мазки на чистых обезжиренных предметных стеклах. Мазки высушивают и фиксируют этанолом в течение 40 мин.

В качестве положительного и отрицательного контролей используют инактивированные культуры M. bovis BCG (положительный контроль) и M. avium 1603 (отрицательный контроль), которые готовят как и бактериальные культуры.

2.1. Сыворотки

В качестве промежуточной сыворотки используется видоспецифическая сыворотка против M.bovis – M. tuberculosis, изготовленная РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси».

В качестве люминесцирующей сыворотки используется промышленная сыворотка, афинная к видоспецифической, меченная ФИТЦ (люминесцирующие сыворотки Московского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи).

Для контрастирования неспецифического све­чения используется альбумин, меченный родамином, выпускаемый ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.

2.2. В пробирки с исследуемыми препаратами вносят по 0,5 мл забуференного физиологического раствора (рН 7,2 - 7,4), активно встряхивают в течение 1 минуты (или на приборе типа «Вортекс») и центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об/мин.

2.3. Методика окраски препаратов.

В пробирки с исследуемыми препаратами вносят промежуточную сыворотку, содержащую видоспецифические иммуноглобулины в объеме 0,2 мл, перемешивают и помещают на 45 минут в термостат при температуре +37°С. Затем пробы центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. В пробирки вносят по 0,3 мл забуференного физиологического раствора. Этапы повторяют с люминесцирующей сывороткой (в каждую пробирку вносят по 0,15 мл) и бычьим альбумином, меченным родамином С (в каждую пробирку вносят по 0,1 мл). Затем осадок суспензируют в 0,2 мл забуференного физиологического раствора, встряхивают и исследуют под микроскопом.

Окрашивание мазков на стеклах. На мазки наносят промежуточную сыворотку, содержащую видоспецифические иммуноглобулины в объеме 0,2 мл (мазок должен быть полностью покрыт сывороткой), помещают на 45 минут в термостат во влажной камере при температуре +37°С. Сыворотку смывают забуференным физиологическим раствором. Этапы повторяют с люминесцирующей сывороткой (наносят 0,15 мл) и бычьим альбумином, меченным родамином С (наносят 0,1 мл). Затем стекла подсушивают и исследуют под микроскопом.

2.4. Методика люминесцентного микроскопирования

Микроскопию препаратов проводят в падаю­щем свете на люминесцентном микроскопе (МЛ-2, или другом) с помощью иммерсионной системы (иммерсионный объектив ахромат 90x1,25 и окуляр 7 или 10) и верхнего освещения через опак-иллюминатор, в сине-фиоле­товых лучах видимого спектра. Используют сочетание первичных светофильтров возбуждения ФC-l-2, C-C-15-2, Б-С-82 и запирающего светофильтра T-2-Н, сила тока 4,5А. Все наблюдения ведутся в затемнен­ном помещении. В качестве иммерсионного масла применяется нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат.

Перед просмотром под микроскопом на подготовленное предметное стекло наносят препарат и накрывают его покровным стеклом. На покровное стекло сверху наносят каплю нефлюоресцирующего иммерсионного масла или диметилфталата. При приготовлении мазков на стеклах микроскопию ведут без покровного стекла.

Интенсивность специфической флюоресценции не одинакова и оценивается по следующей системе обозначений: /++++/ - очень яркая изумрудно-зеленая люминесценция периферии клетки, внутриклеточных включений; /+++/ - яркое периферическое и диффузное свечение; /++/ или /+/ - слабое свечение; /-/ — люминесценция отсутствует.

3. Интерпретация результатов

3.1 Результат реакции считается положительным (культуру относят к M. bovis - M.tuberculosis) при интенсивности свечения исследуемых проб и мазков из положительного контроля /+++/ и более и отсутствии свечения мазков отрицательного контроля.