МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЗВРЕДНОСТИ АНТИБИОТИКОВ И ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СПЕРМИЕВ ЖИВОТНЫХ

При определении безвредности; антибиотиков для спермиев животных необходимо иметь:

а) сперму производителей (активность не ниже 7,0; концентрация не менее 0,6 млрд/мл;

б) 2,8%-ный раствор натрия лимоннокислого (трехзамещенного пятиводного);

в) желток куриных яиц;

г) микроскоп с термостатом или обогревательным столиком;

д) чистую стерильную лабораторную посуду.

Вначале готовят на дистиллированной воде 2,8%-ный раствор цитрата и добавляют к нему 7-10% желтка свежих куриных яиц. Приготовленный раствор разливают в чистые, стерильные пробирки (можно использовать и флаконы из-под антибиотиков).

Каждую серию антибиотика проверяют в трех повторностях с использованием спермы одного эякулята. Поэтому одновременно для проверки одной серии готовят 3 ряда пробирок.

При исследовании стрептомицина в ряд из 6 пробирок вносят раствор цитрата с желтком в количестве: в пробирку № 1 –9 мл; в пробирки № 2, 4, 5 и 6 — по 5 мл и в пробирку № 3 — 8 мл. При исследовании пенициллина составляют ряд из 7 пробирок и вносят указанной среды в пробирку № 1 — 8 мл, а в остальные (№ 2, 3, 4, 5, 6 и 7) — по 5 мл.

Исследуемые антибиотики растворяют во флаконах заводской расфасовки (28-30%-ным раствором цитрата с желтком с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 100 тыс. единиц препарата. Для этого при расфасовке стрептомицина или пенициллина по 1 млн., 500 тыс., 300 тыс., 250 тыс., 200 тыс.. 100 тыс. ЕД во флаконы добавляют соответственно по 10; 5; 3; 2,5; 2 и 1 мл раствора цитрата с желтком.

Растворенный антибиотик переносят мерной стеклянной пипеткой в пробирку № 1 (с раствором цитрата и желтка) в количестве стрептомицина 1 мл, пенициллина 2 мл. Следовательно, при исследовании стрептомицина в пробирке № 1 концентрация его будет 10 тыс. ЕД, а при исследовании пенициллина 20 тыс. ЕД/мл. Раствор исследуемого антибиотика в пробирке № 1 тщательно перемешивают путем встряхивания и делают последовательные разведения следующим образом:

а) при исследовании стрептомицина из пробирки № 1 в пробирку № 2 переносят 5 мл. Тщательно перемешивают и переносят в пробирку № 3 — 2 мл, а 3 мл выливают.

б) при исследовании пенициллина из пробирки № 1 переносят 5 мл раствора в пробирку № 2 и тщательно перемешивают; из пробирки № 2 переносят 5 мл в пробирку № 3 и т.д. Из шестой пробирки 5 мл раствора выливают. Пробирка № 7 служит контролем (пенициллин не добавляют). Таким образом, в результате последовательных разведений в опытных пробирках пенициллин содержится в следующих концентрациях: 20 тыс.; 10 тыс.; 5 тыс.; 2,5 тыс.; 1,25 тыс.; 0,625 тыс. ЕД на 1 мл среды.

В каждую опытную и контрольную пробирку стерильной пипеткой вносят 0,2-0,3 мл свежеполученной спермы. Легким вращательным движением перемешивают содержимое пробирок и оставляют при комнатной температуре на 3 часа. Через 3 часа проводят оценку проб разбавленной спермы по подвижности спермиев под микроскопом при температуре 41-42°С.

Для этого на чистое предметное стекло наносят небольшую каплю разбавленной спермы и 1 каплю 2,8%-ного раствора цитрата, 3—4 капли этого же раствора наносят также вокруг разбавленной спермы, отступя, на 2-3 мм. После накрывания покровным стеклом капля разбавленной спермы оказывается в центре, а раствор, по краям. Раствор цитрата должен выходить за пределы края покровного стекла. Такое приготовление предупреждает преждевременное подсыхание капли и создает хорошую видимость спермиев в поле зрения микроскопа, что очень важно для правильной оценки качества спермы. После определения подвижности спермиев пробы ставят в холодильник при температуре 2-5°С.

Качество спермы (по подвижности) определяют ежедневно до активности 1,0 балла включительно. После чего определяют абсолютную выживаемость спермиев.