Разработка методик качественного анализа травы полыни эстрагон.

Исследования химического состава травы полыни эстрагон позволили сформулировать подходы к стандартизации и разработать методики качественного и количественного анализа травы полыни эстрагон с учетом принципа унификации в ряду: сырье-субстанция- лекформа, а также необходимости валидации методов анализа [3, 6, 137, 138, 153, 155].

На основании проведенного химического изучения травы полыни эстрагон (глава 3), доказано присутствие в сырье флавоноидов. Для проведения качественного анализа сырья нами предлагается использовать:

1. Реакцию с 2 % раствором А1С1з (желто-зеленое окрашивание);

2. ТСХ-анализ [153].

Для количественного анализа травы полыни эстрагон нами предложен метод дифференциальной УФ-спектрофотометрии [152].

Качественный анализ травы полыни эстрагон

Исследованы образцы травы полыни эстрагон (сорт “Грибовский”), культивируемой на Средне-Волжской зонально-опытной станции ВИЛАР (Самарская область).

Для качественного анализа сырья использован метод ТСХ-анализа, позволяющий определять набор доминирующих флавоноидов, характерный для травы полыни эстрагон [23, 31, 55].

Извлечение из травы полыни эстрагон получали путем экстракции образцов сырья полыни эстрагон водой и этиловым спиртом различной концентрации при нагревании на водяной бане. Исследовано влияние условий экстракции (концентрация экстрагента, соотношение “сырье- экстрагент”, время экстракции) на извлечение БАВ - флавоноидов из ЛРС - травы полыни эстрагон.

Таблица 14

Влияние условий экстракции на извлечение флавоноидов из травы полыни эстрагон

Фитохимическое исследование осуществляли

хроматографированием водно-спиртовых извлечений в тонком слое сорбента на пластинках “Силуфол УФ-254”, “Сорбфил-ПТСХ-А-А-УФ” или “Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ” в системе А (рис.

Хроматографирование в системе А позволило обнаружить доминирующие диагностические признаки травы полыни эстрагон: флавоноиды - эстрагонозид (Rf = 0,48) и пиноцембрин (Rf = 0,9), хотя в данных условиях хроматографирования также обнаруживаются:

флавоноиды - тархунозид (Rf = 0,6), нарингенин (Rf = 0,8);

фенилпропаноид - цикориевая кислота (Rf = 0,4); фенолкарбоновая кислота - п-гидроксибензойная кислота.

Результаты проведенных исследований позволяют предложить методику качественного анализа, разработанную для травы полыни эстрагон.

Методика получения водно-спиртового извлечения для анализа.

Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 50 мл и прибавляют 10 мл 70 % этилового спирта. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 24 часов. Затем содержимое колбы охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой.

Подлинность. На линию старта пластинки “Силуфол УФ-254”, “Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ” или “Сорбфил-ПТСХ-А-А-УФ”

микропипеткой наносят 30 мкл водно-спиртового извлечения травы полыни эстрагон, В качестве стандартов использовали индивидуальные вещества, выделенные нами из сырья исследуемого растения: эстрагонозид, пиноцембрин, тархунозид, нарингенин, цикориевую кислоту и п-гидроксибензойную кислоту.

Хроматографическую пластинку помещают в камеру, которую предварительно насыщают 24 часа смесью растворителей: хлороформ - метиловый спирт - вода (26:14:3), и хроматографируют восходящим способом.

Когда фронт растворителей пройдет около 13 см (силуфол) или 8 см (сорбфил), пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин и просматривают в УФ- свете при длине волны 254 нм и 366 нм. На хроматограмме основные вещества травы полыни эстрагон обнаруживаются в виде пятен фиолетового свечения. На хроматограмме

допускается наличие пятен ярко-голубого свечения, соответствующие веществам кумариновой природы. При проявлении хроматограммы щелочным раствором диазобензолсулъфокислоты (ДСК) и нагревания хроматографической пластинки при Т=100-105 °С происходит окрашивание доминирующих компонентов в соответствующий цвет (рис. 34, глава 5): эстрагонозид (1) (вещество с Rf= 0,48; желтое окрашивание), тархунозид (2) (вещество с Rf = 0,6; бледно-желтое окрашивание); нарингенин (3) (вещество с Rf= 0,8; желтое окрашивание), пиноцембрин (4) (вещество с Rf = 0,9; ярко-оранжевое окрашивание), цикориевая кислота (7) (вещество с Rf = 0,4; коричневое окрашивание), п- гидроксибензойная кислота (8) (вещество с Rf = 0,78; бледно-желтое окрашивание) (рис. 34, глава 5).

В методике качественного анализа объем наносимых проб 0,5 % растворов-свидетелей эстрагонозида, пиноцембрина, тархунозида, нарингенина составляет 10 мкл, причем предел обнаружения данных флавоноидов находится на уровне 0,001, 0,0005, 0,001 и 0,0005 мг соответственно.

Тест пригодности хроматографической системы.

На линию старта пластинки пластинки “Силуфол УФ-254”, “Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ” или “Сорбфил-ПТСХ-А-А-УФ”

микропипеткой наносят 10 мл 0,5 % спиртовых растворов эстрагонозида, пиноцембрина, тархунозида, нарингенина, цикориевой кислоты и п- гидроксибензойной кислоты; хроматографическую пластинку помещают в камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 часов, смесью хлороформ - метиловый спирт - вода (26:14:3) и хроматографируют восходящим способом. На хроматограмме при просмотре в УФ-свете при длине волны 254 нм должны обнаруживаться 6 пятен фиолетового цвета.

Примечание. Подготовка хроматографических пластинок.

Пластинки “Силуфол УФ-254” 5x15 см, “Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ” или “Сорбфил-ПТСХ-А-А-УФ” (ТУ 26-11-17-89) перед использованием активируют в сушильном шкафу при 100-105 °С в течение 1 ч.,

Следовательно, результаты проведенных исследований позволяют сделать следующие выводы:

1. При помощи метода тонкослойной хроматографии нами был разработан качественный анализ травы полыни эстрагон, позволяющий обнаруживать два доминирующих флавоноида растения - эстрагонозид (1) в виде желтого пятна с Rf= 0,48 и пиноцембрин (4) в виде ярко- оранжевого пятна с Rf = 0,9.

2. Разработанная нами методика качественного ТСХ-анализа травы полыни эстрагон рекомендована для включения в проект фармакопейной статьи (ФС) на новый вид лекарственного растительного сырья “Полыни эстрагон трава”.

4.2.