Исследование травы полыни эстрагон методом ВЭЖХ

С целью расширения возможностей в плане стандартизации сырья и разрабатываемых препаратов полыни эстрагон нами изучена возможность использования для этих целей метода ВЭЖХ.

Кроме того, в плане проявления антибактериальной активности полыни эстрагон немаловажную роль играют флавоноидные соединения, в частности, пиноцембрин [20], что является основанием для оценки качества травы полыни эстрагон и настойки полыни эстрагон - нового антимикробного средства - по содержанию флавоноидов (пиноцембрина).

Для определения содержания этого вещества в траве полыни эстрагон был использован метод ВЭЖХ (рис. 29) [109].

Для исследования были взяты образцы травы полыни эстрагон (сорт ’Трибовский”), культивируемой на Средне-Волжской зонально-опытной станции ВИЛАР.

Методика приготовления извлечения из травы полыни эстрагон

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл и прибавляют 40 мл 70 %-ного этилового спирта. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Затем содержимое колбы охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой. 1 мл экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 95 %-ным этиловым спиртом до метки.

Подготовка элюента

При проведении анализа использовали “ацетонитрил - вода” в соотношении 50:50 об.%. Подготовка элюента заключается в смешивании чистых растворителей, обработке готовой смеси ультразвуком с целью дегазирования. Для очистки от механических примесей проводилась фильтрация через бумажный фильтр с синей полосой.

Хроматографический анализ полыни эстрагон

Исследования проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе “Милихром-1”.

В процессе анализа определяли времена удерживания сорбатов и время удерживания несорбирующегося вещества t м.

Характеристики хроматографической системы и условия анализа тархуна представлены в таблице 17.

Таблица 17

Характеристика условии хроматографического анализа травы полыни эстрагон

Вследствие высокой полярности данного класса соединений эксперимент проводился в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. В связи с необходимостью получения полностью разделенных пиков компонентов тархуна изучались элюенты различного состава “метанол-вода”, “этанол- вода”, “ацетонитрил-вода”. Несмотря на наличие литературных данных о разделении веществ этого класса соединений [224], при использовании элюентов “метанол-вода”, “этанол-вода” нами не было достигнуто хорошего разделения. Наиболее оптимальной оказалась подвижная фаза состава “ацетонитрил-вода” (50:50 об.%), с использованием которой нами проведен качественный (рис. 29а) и количественный (рис. 296) анализ пиноцембрина в водно-спиртовом извлечении тархуна. На рис. 29 приведены хроматограммы водно-спиртовом извлечении полыни эстрагон, полученные на колонке сепарон Cis с использованием элюента “ацетонитрил-вода” (50:50 об.%).

Идентификация пика пиноцембрина проводилась по сопоставлению времен удерживания t_R и факторов удерживания к государственного стандартного образца пиноцембрина.

к _ Ir —

t * О)

¹м

где t_R - время удерживания анализируемого вещества;

- время удерживания несорбирующегося вещества.

В качестве несорбирующегося вещества нами использован нитрат натрия. В условиях анализа время удерживания пиноцембрина составило

Рис. 29. Хроматограмма водно-спиртового извлечения травы полыни эстрагон (метод ВЭЖХ)

Колонка: стальная, 120x2 мм; неподвижная фаза: сепарон Cis! подвижная фаза: ацетонитрил - вода (50:50 об.%), детектор: УФ, Л=290 нм, А=12,8; 1,6.

а) экстракт тархуна без стандарта: 7,2 - неидентифицированные

компоненты; 3 - пиноцембрин.

б) экстракт тархуна со стандартом (пиностробин): 7,2 -

неидентифицированные компоненты; 3 - пиноцембрин; 4 - пиностробин.

tR=5' 45", фактор удерживания k=4,48.

Количественный анализ пиноцембрина в водно-спиртовом

извлечении полыни эстрагон проводили методом внутреннего стандарта. Данный метод заключается в хроматографировании известного количества анализируемой пробы, к которой добавлено известное количество вещества-стандарта. В качестве стандарта использован государственный стандартный образец (ГСО) пиностробин [4, 69], который, также как и пиноцембрин, относится к флаванонам.

Концентрацию пиноцембрина в экстракте рассчитывали согласно формуле:

ст

(2)

где кі - коэффициент чувствительности детектора к пиноцембрину относительно стандарта (пиностробина);

Qi, Q(cm)i - площади пиков анализируемого вещества (пиноцембрина) и стандарта (пиностробина) соответственно, мм²;

г - отношение массы стандарта к массе анализируемой пробы без стандарта.

Площадь пика рассчитывали по методу треугольника, то есть высоту пика умножали на его ширину на половине высоты.

Допуская, что коэффициент чувствительности детектора к пиноцембрину относительно стандарта равен 1 по причине близости физико-химических свойств пиноцембрина и пиностробина, уравнение (2) примет вид:

Qcm

• 100•г

(3)

Преимущество метода внутреннего стандарта заключается в получении данных из одного цикла анализа, что повышает точность анализа. Результаты количественного анализа приведены в таблице 18.

Результаты количественного анализа пиноцембрина

Таблица 18

Концентрация биологически активного компонента - флавоноида пиноцембрина, рассчитанная по площади пика, составила в водно- спиртовом извлечении - 0,04 %, в траве полыни эстрагон - 1,6 % соответственно. Содержание пиноцембрина в настойке полыни эстрагон, определенной методом ВЭЖХ, составило в среднем 0,32 %.

Общую погрешность анализа рассчитывали исходя из случайной и систематической составляющих измерений. Результаты расчетов погрешностей при определении концентрации пиноцембрина в водно­спиртовом извлечении полыни эстрагон приведены в таблице 19.

Таблица 19

Оценка систематической и общей погрешности измерений количественного анализа пиноцембрина

В данной таблице:

Sc - стандартное отклонение среднего результата

тд& С - среднее арифметическое значение концентрации пиноцембрина;

п - число анализов;

А_сист ~ систематическая составляющая погрешности, которая рассчитывается согласно следующей формуле:

^сист. = ^к

(5)

где к - коэффициент, принимаемый равным 1,1 при доверительной вероятности Р = 95%;

погрешность

взвешивания; Л/л₀ = Л/и_; = Д/л₂ = О,ООО2 г - погрешность весов; m₀,mj,m₂ - численные значения трех взвешиваний при подготовке пробы образца;

1-N

- погрешность, учитывающая содержание основного

вещества; N - процентное содержание основного компонента;

0,005 - слагаемое, учитывающее погрешность линейки;

0,01 - слагаемое, учитывающее погрешность измерительной лупы; 0,03 - слагаемое, учитывающее погрешность установки и

регулирования параметров хроматографического разделения;

погрешность, устанавливающая границь, доверительного

/ Q( ст )

измерения отношения площадей пиков і - ого компонента и стандарта.

Поскольку

= 74,58 >8, то общая погрешность анализа будет

равна систематической составляющей, что составило 8,95 %.

Таким образом, с помощью метода ВЭЖХ нами проведен качественный и количественный анализ травы полыни эстрагон и препаратах на его основе с использованием ГСО пиностробина. Содержание пиноцембрина в траве полыни эстрагон, рассчитанное по площади пика, составило - 1,6 %, в водно-спиртовом извлечении - 0,04 %, в настойке полыни эстрагон в среднем составила 0,32 % [76].

Результаты проведенных фитохимических и аналитических исследований целесообразно использовать в целях разработки нормативной документации (проект ФС) на новый вид лекарственного растительного сырья "Полыни эстрагон трава”.