Получение стабильно меченных БАВ химическими методами

Биологически активные соединения, меченные атомами стабильных изотопов, можно получать путем прямого химического синтеза, с помощью обменных реакций и другими химическими мето­дами, в частности, с применением ферментативного катализа.

Химические синтезы аминокислот, меченных стабильными изотопами, давно известны и ши­роко освещены, например, в классических работах Дауба. В частности, в них продемонстрированы общие синтетические подходы по получению ¹³С-меченных аминокислот по карбоксильным — СООН- и Соположениям молекул, показана перспективность синтетических подходов. Несмотря на это, очевидно, что химические синтезы сложных соединений часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм аминокислот. Еще одним недостат ком данного подхода к получению ¹³С-аминокислот является то, что в таких аминокислотах мече­ные атомы углерода ¹³С локализуются, как правило, по карбонильным положениям молекулы. Ксожалению, аналоги с таким положением меченого атома мало пригодны для биологических

исследований вследствие возможной потери стабильной метки ¹³С за счет функционирования гочисленных реакций ферментативного декарбоксилирования, происходящих в организме. К этого, до настоящего времени практически не существует подходящего метода для введени в боковые позиции молекулы аминокислоты, так, чтобы каждая стадия химического синтез: ла бы разработана детально. Наиболее успешные синтетические методы введения ¹³С-метки в нокислоты затрагивают, как правило, такие положения в молекулах аминокислот, как метил группа метионина, С₂-кольцевое положение в молекуле гистидина, а также атомы углерода карбоксильных группах аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Более тонкие синтезы стабильно меченных аминокислот были, как правило, свяа с использованием комбинации химических и ферментативных подходов.

Ферментативная стадия часто завершает химический синтез меченых аналогов аминокисл причем использование для этих целей интактных клеток или их экстрактов так же эффектив; как использование очищенных препаратов ферментов. Однако, субстратная специфичность ф ментов, их ограниченная доступность, сложность выделения и очистки ограничивают использо; ние ферментативных систем. Например, разработанная сложная энзиматическая система д получения ¹³М-аланина включает комплексное использование десятка ферментов и имеет выход целевому продукту не более 1 г.

В литературе также описаны способы получения химико-ферментативными методами дейп рий- и ‘³С-аналогов фенилаланина и тирозина, меченных по различным положениям в молекул Синтез ¹³С-тирозина был осуществлен через р-нитрофенол с использованием карбоксипептида; А.

Табл. 3. Ростовые субстраты, используемые для биотехнологического введения стабильной изотопной метки

в продукты биосинтеза различных классов продуцентов

для контролирования включения изотопа ^I5N в молекулы аминокислот, поскольку фермент ката­лизирует разложение серина до пирувата и аммиака.

Получение изотопомеров тирозина и фенилаланина, меченных по фенольному кольцу стабильны­ми изотопами D, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁷О, ¹⁸О, было осуществлено за счет использования клеток бактерий Ervinia herbicola, обладающих высокой активностью также p-тирозиназы.

Очень эффективным оказалось получение ¹⁵1У-Ь-глутамата из (¹⁵NH₄)₂SO₄ и а-кетоглутарата с помощью глутаматдегидрогеназы. Метод изотопного обмена Н -* D, реализуемый в ферментатив­ных системах, позволяет получать оптически активные дейтеро-аминокислоты. Так, описан препаративный метод получения Ь-[2-О]-валина, лейцина, изолейцина и фенилаланина за счет мо­дификации соответствующих субстратов в D₂O при непосредственном участии клеточного экстрак­та из Е. coli. При помощи других ферментов, например, аспартатаминотрансферазы из бактерий Е. coli, которая катализирует Н -» D-обмен в D₂O у С₂-атома в молекуле аспарагиновой кислоты и в фенилаланине, получены дейтерированные аспарагиновая кислота и фенилаланин.

Следует подчеркнуть, что Н -» D обмен водорода на дейтерий у атома С₂ функционирует в реак­циях аминокислот, катализируемых пиридоксальзависимыми ферментами: триптофансинтетазой из Е. coli, а-глутаматтрансаминазой, серинтрансгидроксиметилазой. Как и для других пиридок- салькатализируемых реакций, увеличение подвижности обмениваемого на дейтерий атома водоро­да в положении С₂ может быть объяснено образованием Шиффова основания аминокислоты с пиридоксальфосфатом.

Изотопный обмен Н -* D обычно применяют для замещения легко обмениваемых на дейтерий ароматических протонов в остатках фенилаланина, тирозина, триптофана и гистидина, входя­щих в состав молекул белков. Вследствие того, что замещаемые на дейтерий протии в молекулах белков все же прочно связаны с углеродом и трудно обмениваются в мягких условиях, метод не­сколько ограничен параметрами нестабильности белков в жестких условиях (85 % HC1/H₂SO₄, 80 - 100°С), необходимых для реакций изотопного обмена. Этот же подход применен при получе­нии частично дейтерированных антибиотиков (см. выше).

Несмотря на довольно хорошую проработанность способов химического изотопного обмена, продолжаются поиски все более эффективных методов получения высокодейтерированных амино­кислот. Так, одной из недавних работ авторы установили, что можно повысить Н -» D обмен в С-Н связях аминокислот и коротких пептидов, если помещать их в D₂O обязательно с дитиотриэтолом и проводить радиолиз воды в анаэробных условиях. Однако максимальный уровень дейтерирова- ния, достигаемый в таких экспериментах, не превышал 38 % .

В заключение следует отметить, что, несмотря на многочисленность описанных в литературе подходов по получению биологически активных соединений, меченных стабильными изотопами, в настоящее время не существует универсального подхода, который позволял бы получать амино­кислоты, меченные D, ¹³С, ¹⁵N и ¹⁸О, химико-ферментативным путем за счет включения меченых низкомолекулярных субстратов.

7.