Метилотрофные микроорганизмы как продуценты изотопно меченных БАВ

К метилотрофам относят таксономически весьма разнородную группу микроорганизмов, имею­щих одно общее свойство — способность использовать одноуглеродные соединения в качестве единственного источника углерода и энергии.

Для изотопной биотехнологии особый интерес представляет использование облигатны метилотрофных бактерий в качестве продуцентов стабильно меченных БАВ. Облигатность эти микроорганизмов полностью исключает возможность разбавления изотопной метки, присутству ющей в молекулах метанола, атомами каких либо иных источников углерода и энергии. Кром того, у исследованных бактерий не обнаружено способности фиксировать атмосферный азот. Оч< видно, что данные свойства чрезвычайно полезны при получении тотально дейтерированных тотально ¹³С-меченных и ¹⁵1М-меченных соединений, а также стабильно меченных БАВ, несущи, множественную метку.

Метилотрофы всегда рассматривались как возможные продуценты белка одноклеточных и дру гих БАВ. Сравнительные исследования биотехнологического потенциала представителей разньг групп метилотрофных бактерий показали, что многие метилотрофные культуры достаточно эффе ктивно используют субстраты и отличаются высокими ростовыми характеристиками.

Метилотрофные микроорганизмы разделяют на облигатные метилотрофы, способные раст только на Сі-субстратах, не содержащих С-С связей, и на факультативные метилотрофы, ис пользующие наряду с одноуглеродными соединениями различные полиуглеродные субстраты Соответственно, микроорганизмы, использующие (^-соединения в качестве единственного истом ника углерода и энергии, должны синтезировать все более сложные молекулы с С-С связям: de novo. Это свойство метилотрофов оказалось очень полезным для использования их в качеств продуцентов БАВ тотально меченных стабильными изотопами. Действительно, способность усваи вать только метанол и любые его меченые аналоги (CD₃OD, ¹³СН₃ОН, СН₃¹⁸ОН, с двойными метка ми ¹³CD₃OD, ¹³СН₃¹⁸ОН, CD₃¹⁸OD и трижды меченный ¹³CD₃¹⁸OD) для построения всех компоненто живой микробной клетки, гарантирует от разбавления изотопной метки в конечном продукті Кроме того, как отмечалось выше, метилотрофы не способны фиксировать атмосферный азот и следовательно, можно не опасаться разведения азотной метки ¹⁵NH₄C1.

Известны два биотехнологических уровня реализации уникальных свойств метилотрофов ка: продуцентов изотопно меченных БАВ (рис. 2). Первый уровень включает культивирование собст венно метилотрофных продуцентов целевых соединений на относительно дешевых минимальны, ростовых средах с неорганическими источниками (кроме метанола) меченых атомов. Второй состо ит в использовании гидролизатов меченой биомассы метилотрофов в качестве основы изотопно ме ченных полноценных ростовых сред для иных — гетеротрофных продуцентов целевых БАВ. Мети

Рис.2 Схема биотехнологического метода получения стабильно меченных ВАВ на основе использования метилотрофных микроорганизмов

лотрофные продуценты для биотехнологического получения индивидуальных меченых биологиче­ски активных соединений выглядят предпочтительнее, когда рассматриваются вопросы производ­ства таких важных продуктов биосинтеза как аминокислоты, витамины, экзополисахариды, липиды, поли-р-гидроксибутираты и каротиноиды.

К настоящему времени для некоторых видов метилотрофов разработаны генноинженерные сис­темы переноса наследственной информации, что дало возможность использовать соответствующие штаммы в качестве продуцентов меченых «клонированных белков». В частности, для получения белков эукариот путем гетерологичной экспрессии соответствующих генов все чаще используют клетки метилотрофных дрожжей. В этом случае обеспечивается нативная упаковка пептидной це­пи, правильное формирование дисульфидных связей, гликозилирование и в некоторых случаях се­креция целевого белка: Аналогично получают и стабильно меченные белки для ЯМР-анализов, выделяя их из продуктов культивирования метилотрофных дрожжей Pichia pastoris на соответст­венно стабильно меченных средах. Следует обратить внимание на то, что при культивировании в ферментере можно получать значительные количества таких меченых белков.

Полученные на первом этапе процесса гидролизаты меченой биомассы метилотрофов использу­ются в качестве основы полноценных тотально изотопно меченных ростовых сред. При необходи­мости в такие среды могут включаться и тотально меченные БАВ, секретируемые метилотрофами (например, экзополисахариды как изотопно меченные заменители крахмала). Данный подход по­зволяет сравнительно просто подбирать необходимые компоненты изотопно меченных аналогов оптимальных по составу сред для культивирования уже существующих гетеротрофных сверхпро­дуцентов многих целевых соединений.

Важно отметить, что при получении гидролизатов меченной биомассы могут быть реутилизиро- ваны все дорогостоящие изотопно меченные отходы предыдущих культивирований. В частности, разработаны методики, обеспечивающие практически полную реутилизацию D₂O, остающейся по­сле биосинтеза униформно дейтерированных БАВ. Полная реутилизация проводится в две стадии:

1) перегонка культуральной жидкости для очистки от продуктов жизнедеятельности,

2) дообогащение по дейтерию до уровня 99,5 ат. % D.

Таким образом биотехнологический подход обеспечивает практически полную безотходность процессов получения биологически активных соединений меченных атомами стабильных изото­пов, что позволяет существенно снизить расходы на получение целевых стабильно меченных БАВ, особенно высокодейтерированных.

Заканчивая данную главу, посвященную вопросам получения и использования биологически активных соединений, меченных стабильными изотопами, следует еще раз подчеркнуть широчай­шие перспективы использования биотехнологии стабильных изотопов для научно-исследователь­ской и медицинской практики.

Дополнительная литература

1.Лобышев В. А. Действие тяжелой воды на живые объекты./М.: Наука, — 1989.

2. Мосин О. В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В. И. Методы получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами ²Н, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁸О./Биотехнология. — 1996. — № 10. — 24-40 стр.

3. Складнев Д. А., Рогожкина Е. А., Кондакова Е. В. и др. Получение изотопно модифициро­ванного ¹³С + ¹⁶N пептидного антибиотика зервамицина ИВ /Биотехнология. — 2002. — № 5. 33-41 стр.

Контрольные вопросы

1. Общие представления о радиоактивных и стабильных изотопах основных элементов, входящих в биологически активные соединения.

2. Дейтерий, изотопный состав и общие свойства D₂O и Н₂О, история изучения влияния D₂O на био­логические объекты.

3. Влияние D₂O на различные биологические объекты. Терапевтическое действие D₂O.

4. Исследования, основанные на использовании физических свойств D₂0.

5. Исследование механизмов действия антибиотиков с применением D₂0.

6. Использование D₂O при исследованиях липидного обмена.

7. Исследование белковых структур и ориентации белков в мембрана с применением D₂O.

8. Использование D₂O при изучении фотореакций, «пурпурных мембран» и фоточувствительных белков в D₂O.

9. Использование индивидуальных дейтерированных белков в научных исследованиях. Новые свойства дейтерированных аналогов БАВ.

10. Применение изотопных вариантов ^l3C-, ¹⁵N- и ¹⁸О-меченных БАВ.

11. Особенности использования в исследованиях множественно изотопно меченных БАВ.

12. Особенности культивирования микроорганизмов на высокодейтерированных средах. Микрово- доросли как продуценты дейтерированных соединений.

13. Биотехнологический способ получения ¹³С-, ¹⁵N-, ¹⁸О-меченных, а также множественно изотоп но меченных биологически активных соединений.

14. Получение стабильно меченных БАВ путем химического или ферментативного синтеза, а так же иными методами.

4.