Применение низкомолекулярных индивидуальных дейтерированных БАВ в научных исследованиях

Индивидуальные дейтерированные БАВ применяются в самых разных исследованиях тогда, когда надо определить пути миграции конкретного соединения в организме, оценить время суще­ствования его в клетках или тканях, а также для определения продуктов его взаимодействия с дру­гими компонентами окружения.

Дольше других и более широко используются низкомолекулярные дейтеросоединения. Часто в такого рода исследованиях используют серию из нескольких аналогов изотопно меченных БАВ, отличающихся положением меченых атомов или групп. Так, при исследовании влияния этанола на липидный обмена в клетках гепатоцитов использовали два аналога дейтеро-глиперина — [1,1,3,3-D₄]- и [2-Б]-глицерин. Анализ распределения дейтериевой метки позволил зафиксировать наличие двух функционально различающихся пулов sn-глицерин-З-фосфата.

В начале эпохи использования дейтерированных БАВ много работ было сделано с использовани­ем дейтеро-сахаров. Наблюдая за включением дейтериевой метки из молекул [2-Б]-глюкозы в те или иные фрагменты co-циклогексил жирных кислот ацидофильных термофильных бактерий, установили, что метка чаще всего встречается во втором положении циклогексильного кольца, т. е. это кольцо синтезируется непосредственно из экзогенной глюкозы. Аналогично, по включе­нию метки в молекулы ш -циклогексил жирных кислот, показана вовлеченность шикимата и цик- логексилкарбоксилата в данную ветвь биосинтеза в качестве интермедиатов. Тот же подход был использован для подтверждения включение ББ-[3,3-Б₂]-серина в синтез сфинголипидов клетками скользящих бактерий Cytophaga johnsonae.

Более сложная схема исследования была реализована при изучении фрагментации молекулы противоопухолевого антибиотика стауроспорина. На первом этапе авторы выделяли препараты антибиотика, получившего метку от одного из четырех источников: Б-[6,6-Б₂]-глюкоза.

Как уже неоднократно подчеркивалось, не только D₂O, но и более сложные дейтеро-соединения можно свободно использовать непосредственно на людях, даже на больных. Именно эта особен ность способствует постепенному вытеснению радиоизотопов и расширению вовлечения стабильно

меченных БАВ в практику медицины. Известно, что нарушения углеводного метаболизма могут приводить к тяжелым заболеваниям человека. Методами высокого разрешения исследовали гли­когенолиз и глюконеогенез в клетках печени у представительной выборки здоровых субъектов и больных циррозом печени. Уровень глюконеогенеза вычисляли как разницу в доли синтезиро­ванной глюкозы, определенной после введения [6,6-В₂]-глюкозы и уровнем гликогенолиза. Изме­ряли также вклад глюконеогенеза в синтез глюкозы крови путем измерения уровня дейтериевой метки в С5/С2 положениях после получения испытуемыми тяжелой воды (5 мл/кг жидкости, содержащейся в теле субъекта). Авторы сделали важный вывод — больные циррозом печени име­ли заметно увеличенный уровень глюконеогенеза и сниженный уровень гликогенолиза по сравне­нию с контрольной группой.

Обратила на себя внимание сравнительно недавняя работа израильских ученых, посвященная долговременному использование фруктозы в питании в качестве единственного сахара. Фрукто­за, как известно, в естественных условиях в больших количествах встречается в медах и сладких фруктах, ныне производится в кристаллическом виде и в виде глюкозо-фруктозного сиропа (ГФС). Коммерческое использование фруктозы в обработанной пище существенно повысилось за послед­ние 25 лет. Долговременное использование фруктозы в рационе мышей, как оказалось, приводило к таким же изменениям в структуре коллагена, какие происходят при старении организма. Мыши получали фруктозу в течение года в довольно высоких концентрациях 12,5 г/кг (эта доза соответ­ствует потреблению ребенком 30-40 стаканчиков йогурта в день).

Ранее было показано, что фруктоза уменьшает толерантность к глюкозе, изменяет метаболизм инсулина и ускоряет процесс гликозилирования (реакция сахара и белков), который сопровожда­ет нормальный процесс старения, а также имеет место при некоторых осложнениях диабета. В этой серии экспериментов обнаружили, что у крыс, получавших фруктозу, ее содержание в крови, а также холестерина и гликозилированного гемоглобина были значительно повышены. Кроме то­го, фруктоза увеличивала частоту внутримолекулярных и межмолекулярных сшивок коллагена кожи, что вызывает снижение ее эластичности и мягкости. Другими словами — долговременное использование фруктозы приводит к увяданию кожи. Полученные данные, возможно, подведут черту под «фруктозным бумом» последних лет. Не менее важный вывод состоит в том, что требует­ся продолжение исследований влияния фруктозы на организм человека, а также более тщательное осмысление вопросов, связанных с безопасностью потребления этого сахара как здоровыми, так и диабетическими индивидуумами.

Использование точечно меченных соединений широко используется для определения участия соответствующих атомов или молекулярных групп в ферментативных реакциях. Так, применение [б-Бргалактозы позволило лучше понять механизм каталитического цикла га- лактозооксидазы. В этом цикле обязательно присутствует стадия, на которой фермент содержит свободный радикал, ассоциированный с атомом Си в активном центре. Фермент катализирует двухэлектронное окисление молекулы спирта до альдегида с соответствующим восстановлением О₂ до Н₂О₂. Исследователи использовали метод быстрого определения кинетики для измерения анаэробного восстановления субстрата галактозооксидазы в сочетании с разработанным ими спо­собом, основанным на применении С6-протонированного и С6-дейтерированного субстратов в Н₂О и D_ZO. Так было показано, что обмениваемые протоны не участвуют в кинетически значи­мых этапах реакции, и что атом водорода, отрывающийся от молекулы галактозы, не теряется в растворе в ходе каталитической реакции, а, напротив, участвует в узловом моменте последую­щей реакции с кислородом.

В качестве источника дейтериевой метки могут выступать не только углеводы, но и жирные кис­лоты. Именно благодаря использованию [2,2-В₂]-пальмитиновой кислоты для введения изотопной метки в целые клетки Claisen matruchotti и сравнительному исследованию природных и дейтери­рованных кориномиколатов, установлен внутриклеточный механизм конденсации пальмитата, не включающий постулированную ранее стадию карбоксилирования. Это открытие позволило пред­ложить схему химического синтеза нескольких родственных ингибиторов реакции конденсации, которые, как показано, обладают сильным действием in vivo на С. matruchotti и при концентрации 1—10 мкг/мл полностью подавляют рост колоний.

Расширяется использование искусственных мембран при изучении функциони рования белков и других клеточных структур. Такие исследования требуют разработки методов возможно более точного воссоздания природного состава мембран. Для исследования механизмов слияния везикул искусственных мембран в качестве метки использовали дейтеро-холин. Конформационные изменения, возникающие при смешивании разных липидов в процессе слияния везикул, регистри­руются на D-ЯМР-спектрах как изменения в квадруполярном сплайсинге. Используя количествен­ную модель, удалось оценивать степень слияния между везикулами с противоположными зарядами и добиться 100 % -ного слияния малых униламеллярных везикул, состоящих из положительно за­ряженных (1,2-диолеоулоксу-3-(диметил-аммонио)пропан : 1-пальмитоил-2-олеоил-зп-глицеро-3- фосфохолин : 1-альмитоил-2-олеоил-ап-глицеро-3-фосфоэтаноламин в соотношении 40 : 40 : 20) с большими униламеллярными везикулами (1-пальмитоил-2-олеоил-8п-глицеро-3-фосфо-холин : холестерин : 1-пальмитоил-2-олеоил-8га-глицеро-3-фосфогли-церин — 60:30: 10). Подобные иссле­дования имеют большое значение, поскольку воспроизведение природного липидного окружения модельных белков крайне важно для исследования их работы в мембранах — везикулах.

В качестве примера использования индивидуальных дейтероаминокислопг можно привести недавнюю работу, посвященную изучению кинетики реакции оксидазы П-аминокислот (ЕС 1.4.3.3) изклеток Trigonopsis variabilis.

Еще одна работа по одновременному использованию двойной — дейтериевой и фтор ¹⁹Е-метки. В данном случае для мечения белка грамицидина использовали триптофан, содержащий 5 атомов дейтерия в индольном кольце (ранее подобные исследования были проделаны с четырьмя вариан­тами дейтеро-триптофана — по разным положениям дейтерия в кольце). Исследования позволили заключить, что a-спираль белка ориентирована параллельно нормали мембраны, а триптофаны в 11, 13 и 15-м положениях грамицидина непосредственно участвуют в «дипольном эффекте», т. е. в прохождении заряда сквозь мембрану.

Расширяется использование дейтеро-аминокислот при изучении биосинтетических процессов вы­сших растений. Так, с помощью введения изотопной метки в культуру клеток Asparagus officinalis (Ь-[2,3,3-В₃]-фенилаланин, В,Ь-[3,3-П₂]-фенилаланин) получали препараты дейтеро-аспарениола и 4-[5-(4-метоксифенокси)]-3-пентен-1-иниллфенол. Исследователи установили, что С9 атом фраг­мента (- СН = СН - СН₂ - О - С_вН₄ - О -) поступает из молекулы фенилаланина, что подтвердило устоявшееся представление о последовательности реакций биосинтеза норлигнана у этого растения.

4.2.