Липидные поры при стрессовых воздействиях.

Биологические мембраны находятся под действием электрического поля большой напря­жённости, создаваемого диффузией ионов через мембрану и электроген- ными ионными насосами. Поскольку разность потенциалов между цитоплазмой и внеклеточной средой достигает порядка 0,1 В, а толщина мембраны не превышает 10 нм, то напряжённость поля равна 10⁷ В/м.

Таким образом, мембрана является более совершенным электричес­ким изолятором, чем многие жидкие изоляторы, применяемые в технике. В некоторых случаях мембранный потенциал в живой клетке может быть выше и достигать 0,2 В (пресноводные водоросли, бактерии, энергизиро- ванные митохондрии).

В возбудимых нервных и мышечных клетках происходит кратковременная реполяризация мембраны с ростом амплитуды потенциала. Однако пробой клеточной мембраны собственным мембран­ным потенциалом маловероятен.

В то же время рост мембранного потенциала в результате воздей­ствия внешним электрическим полем может достигать величины, превы­шающей пороговую для электрического пробоя. При этом появляются структурные дефекты типа сквозных липидных пор.

Разработанная методика электрического пробоя клеточных мембран получила название электропорации и широко применяется в биотехнологии.

В физике под электрическим пробоем понимают резкое увеличение силы электрического тока в первоначально слабопроводящей среде. В живой клетке такой средой служит липидный бислой.

В этом случае формула зависимости энергии поры от её радиуса должна быть изменена путем введения дополнительного члена, отражаю­щего вклад электрического поля,

мости воды и мембраны соответственно; ср - мембранный потенциал; С_о - ёмкость единицы площади мембраны, не содержащей дефектов.

Зависимость энергии поры от её радиуса для этого случая при­ведена на рисунке 59, на котором представлено семейство кривых, построенных по полученному уравнению для различных значений мембранного потенциала.

Чем больше мембранный потенциал, тем меньше значение энергии поры и тем больше смещается максимум кривой к началу координат.

С увеличением радиуса энергия поры должна, с одной стороны, рас­ти, поскольку увеличивается периметр поры, а, с другой стороны, одно­временно энергия должна уменьшаться пропорционально росту поверх­ностного натяжения мембраны и мембранного потенциала. В результате (рисунок 59), появляется кривая с максимумом, что позволяет количест­венно оценить критические параметры мембраны: критический радиус поры и высоту энергетического барьера.

Высота энергетического барьера с учётом поля равна

Можно видеть, что с ростом мембранного потенциала и поверх­ностного натяжения высота барьера снижается.

Критический радиус поры может быть рассчитан по формуле

Величина критического радиуса также уменьшается с ростом ст и ср. Из формулы следует, что зависимость параметров критической поры от мембранного потенциала становится заметной лишь при значительном превышении электрической составляющей над величиной поверхностного натяжения.

Расчёты показывают, что для липидного бислоя в жидкокристалли­ческом состоянии критическая величина мембранного потенциала не может быть меньше 0,23 В.

Стабильность бислойных мембран определяется вероятностью появления пор критического радиуса. Очевидно, что любой фактор, снижающий высоту энергетического барьера, будет увеличивать эту вероятность. К таким факторам следует отнести

1) снижение краевой энергии поры;

2) рост поверхностного натяжения;

3) рост мембранного потенциала.

Как видно из рисунка 59, рост пробойного напряжения до 1 В сопровождается смещением критического радиуса к значениям меньшим 0,5 нм, что близко радиусам природных ионных каналов клеточной мембраны. Отсюда следует, что электрический пробой сопровождается появлением широкого спектра липидных пор различного радиуса, включая поры с радиусом ионоселективных белковых каналов.

В настоящее время метод воздействия внешним электрическим полем является одним из основных в современной биотехнологии. Известно его применение с целью увеличения пористости мембран (электропорация), введения ДНК (электротрансфекция), освобождение клеток от крупных молекул (электропермеабилизация), слияния клеток (электрослияние).

Температурная обработка бислойных липидных мембран сущест­венно влияет на энергетику порообразования, поскольку фазовый переход сопровождается значительным изменением поверхностного натяжения. Так, например, для гидрированного яичного лецитина при замораживании поверхностное натяжение ст возрастало от 1,1 • К)³ до 5,6 • 10 ³ Н/м.

С учётом этого по формуле Е(г) = 2кгу - кг²а была рассчитана зависимость энергии поры от её радиуса в жидкой и твёрдой мембране (рисунок 60).

Рисунок 60 - Зависимость энергия поры от её радиуса в жидкокристаллическом состоянии (А) и гель-состоянии (Б) мембранных липидов

Как следует из рисунка 60, критический радиус поры в гель- состоянии значительно меньше по сравнению с жидкокристаллическим состоянием и по абсолютной величине не превышает 2 нм. Сохранение длительной устойчивости липидного бислоя в гель-состоянии свидетель­ствует о том, что существующие поры и поры, возникающие при фазовом переходе (жидкокристаллическое состояние) - (гель состояние), имеют размеры меньше 2 нм.

Сравнение рисунков 59 и 60 демонстрирует высокую эффектив­ность метода температурной обработки бислойных липидных мембран с целью получения липидных пор с такими же параметрами, как и при электрическом пробое.

Действительно, замораживание мембранных липидов в ходе фазо­вого перехода (который для многих насыщенных липидов происходит при комнатной температуре) эквивалентно электрическому пробою мембраны внешним электрическим полем напряжением 0,5 В. В то же время очевидно, что электрические воздействия более удобны с точки зрения калибровки силы воздействия и его длительности.

С точки зрения проницаемости липидные поры принципиально отличаются от белковых каналов своим происхождением и исключи­тельной динамичностью.

В то время как белковые каналы имеют строго определённые размеры, сохраняющиеся в течение всей жизни клетки, размеры липидных пор в процессе затекания изменяются в широких пределах. Однако эта изменчивость не безгранична. Если радиус поры меньше критического, то пора в процессе затекания должна пройти все промежуточные радиусы и достигнуть минимального размера.

Вопрос о возможности полного затекания липидных пор остаётся открытым. Предполагается, что полному затягиванию поры препятству­ют мощные силы гидратации, проявляющиеся при сближении стенок гидрофильных пор.

Липидные поры в отличие от белковых ионных каналов не обладают выраженной избирательностью, что коррелирует с их сравнительно большими исходными размерами.

Ясно, однако, что в процессе затекания липидные поры могут достигать сколь угодно малых размеров, в том числе сравнимых с размерами белковых ионных каналов, что может приводить к перераспределению ионных токов в мембране, например, при возбуждении.

Известно далее, что после выключения стрессового воздействия бислойная липидная мембрана может вернуться в состояние с низкой проводимостью, что подразумевает достижение порами размера, недостаточного для прохождения гидратированных ионов.

Таким образом, гидрофильные липидные поры универсальны в том отношении, что могут быть использованы клеткой для транспорта высокомолекулярных веществ, ионов и молекул воды.

Исследования проницаемости липидных пор развиваются в настоя­щее время в двух направлениях: в первом исследуются максимально большие поры, во втором, наоборот, - липидные поры минимального радиуса.

В первом случае речь идёт об электротрансфекции - способе введения в живые клетки или липосомы молекул ДНК с целью переноса и внутриклеточного введения чужеродного генетического материала. Оказалось, что внешнее электрическое поле высокой напряжённости способствует проникновению гигантской молекулы ДНК внутрь мембранной оболочки.

Максимальный размер критической поры соответствует жидко­кристаллическому состоянию бислоя липидов в отсутствие внешнего электрического поля и равен 9 нм. Наложение внешнего электрического поля напряжённостью 100 кВ/м понижает критический радиус поры до 1 нм за время 0,2 с. Поскольку при этом мембраны не разрушаются, то размер липидных пор в них не превышает, очевидно, этого нижнего предела.

Парадокс состоит в том, что эффективный диаметр статистического клубка ДНК, которая должна попасть внутрь частицы, достигает 2000 нм. Поэтому очевидно, что молекула ДНК должна проникать через мембрану в виде расплетенной одиночной нити. Известно, что конец нити имеет диаметр 2 нм и может войти в пору. Однако свободная диффузия нити ДНК в поре при этом вряд ли возможна. В настоящее время механизм этого процесса до конца не ясен.

Предполагается, в частности, что:

1) молекула ДНК способна расширить пору и таким образом проскользнуть через мембрану:

2) проникновению ДНК могут способствовать дополнительные силы электрофореза и электроосмоса с учётом суммарного отрицатель­ного заряда молекулы ДНК:

3) не исключено, также, что поры с фиксированными в них концами молекулы ДНК играют роль якоря, удерживающего молекулу в определённом месте у везикулы на поверхности мембраны, а сам процесс переноса является разновидностью пиноцитоза.

Контрольные вопросы и задания

1. Протекание каких трёх видов процессов обеспечивается селектив­ной проницаемостью биомембран?

2. В чём состоит отличие электрохимического потенциала от хими­ческого потенциала?

3. Запишите уравнения Теорелла и Нернста-Планка.

4. Перечислите виды пассивного трансмембранного транспорта.

5. Какие вещества могут диффундировать через липидный бислой вследствие пассивной (обычной) диффузии?

6. Каким образом мелкие полярные молекулы (например, молекулы воды) диффундируют через биомембрану?

7. Каким образом кинки переносят молекулы воды через мембрану?

8. Какие выделяют виды мембранных белков-транспортёров?

9.

10. Какова характерная скорость переноса ионов через мембрану ионным насосом?

11. Какова характерная скорость переноса молекул и ионов через мембрану белковым каналом?

12. Какие существуют три схемы трансмембранного транспорта с помощью переносчиков-транспортёров?

13. Какие мембранные транспортёры называют котранспортёрами?

14. В чём отличие в работе активных транспортёров (ионных насосов) от вторичных активных транспортёров?

15. Какова характерная скорость переноса молекул через мембрану вторичными активными транспортёрами?

16. В чём сходство и различие простой диффузии и облегченной диф­фузии?

17. Какие существую две разновидности облегчённой диффузии?

18. Перечислите основные отличия облегчённой диффузии от простой.

19. Приведите примеры белков-транспортёров глюкозы семейства GLUT.

20. Какие два основных метода используются для исследования функционирования белков-транспортёров?

21. Каким образом наличие липидных пор влияет на стабильность биомембран?

22. В результате каких внешних воздействий в мембране могут образовываться липидные поры?

23. Какова роль липидных пор в гемолизе эритроцитов?

24. Перечислите основные параметры модели гидрофильной липид­ной поры.

25. Каков количественный критерий стабильности липидной бислой­ной мембраны?

26. Запишите выражение для высоты энергетического барьера липид­ной поры.

27. Запишите выражение для критического радиуса поры.

28. При каких стрессовых воздействиях размеры липидных пор могут превысить критическое значение?

29. Что называется электропорацией биомембраньг?

30. Как изменяется величина критического радиуса поры при пере­ходе из жидкокристаллического в гель-состояние?

31. В чём состоит принципиальное отличие липидных пор от белко­вых каналов с точки зрения проницаемости?

32. Что называется электротрансфекцией биомембраньг?

33. Какие выделяют три разновидности механизма трансфекции ДНК через биомембрану?