Экстрагирование

Экстракционные методы выделения продуктов, используемые в биотехнологии, подразделяют­ся на две основные группы: методы экстрагирования, когда целевой продукт извлекается х т,- костью (экстрагентом) из твердой фазы (рафината) — чаще всего биомассы микроорганизмов, и .ме­тоды жидкостной двухфазной экстракции, в которой продукт, растворенный в жидкой фазе (рафи­нате), извлекается другой жидкостью (экстрагентом) — обычно это органический растворитель.

Экстрагирование из биомассы клеток. Некоторые из продуктов метаболизма можно выделить из биомассы без разрушения клеточных стенок (липиды, некоторые ферменты). В большинстве же случаев используют дезинтеграцию клеток и экстрагированию подвергают дезинтеграт — разру­шенные клетки или их оболочки. Для извлечения БАВ из дрожжей или бактерий необходимо под­вергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффу­зионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтегра­ция культуры грибов не требуется.

Извлечение проводят как из влажных, так и из сухих поверхностных культур грибов. Сухая культура может храниться длительное время, и из нее получают более концентрированные эк­стракты. Технологически это выгоднее, но при подсушивании культуры имеют место потери ак­тивности БАВ, и потому экстрагирование целесообразно вести из влажной культуры. При эк ча- гировании различные водорастворимые вещества извлекаются из культуры с неодинаковой ско­ростью, происходит их частичное фракционирование.

Рис. 24. Схема противоточного 3-ступенчатого экстрагирования

Экстрагирование применяется для извлечения ферментов из культур грибов, выращенных твердофазной ферментацией, микробного жира или липидов из биомассы дрожжей, антибиотиков и полипептидов, локализованных на клетках микроорганизмов, при выделении внутриклетоных, биополимеров типа белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т. д.

Всегда за экстрагированием следует стадия отделения твердой фазы, в результате чего извлекаемое вещество переводится в жидкую фазу — экстракт, из которого в дальнейшем и выделяют продукт.

В качестве экстрагентов в зависимости от вида извлекаемого вещества используются: вода, водные растворы кислот или щелочей, органические растворители — спирты, ацетон и др. Для во­дорастворимых БАВ наилучшим экстрагентом является конечно же вода.

На полноту экстрагирования БАВ из культур оказывают влияние многие факторы: температу­ра, pH, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого БАВ, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и др.

Существует несколько традиционных способов осуществления экстрагирования: экстрагирова­ние с перемешиванием, экстрагирование в неподвижном слое, экстрагирование одно- и многосту­пенчатое, прямоточное и противоточное.

Экстрагирование с перемешиванием является наиболее простым способом экстрагирования. В аппарат с мешалкой загружается твердая фаза (биомасса после сгущения или отделения на фильтре) и жидкая фаза (экстрагент). Процесс далее протекает при перемешивании.

Чтобы более полно извлечь БАВ, целесообразно добавлять растворитель порциями. Сначала следует добавить одну порцию растворителя, затем отделить жидкую фазу от твердой и провести повторное экстрагирование свежим растворителем. Так можно делать несколько раз, а затем объ- единитьэкстракты.

Ищи лучше использовать противоточное экстрагирование: например, при 3-х кратном экстраги­ровании свежую биомассу с наиболее высокой концентрацией извлекаемого вещества соединяют с.экстрактом, полученным после двух операций экстрагирования, а биомассу после 2-го или 3-го экстрагирования — со все более чистым экстрагентом (см.

Экстрагирование в неподвижном слое используется в том случае, когда биомасса влажная или предварительно высушена. Она загружается в колонны или патроны (диффузоры), через которые проходит жидкий экстрагент. Обычно используют батарею из 10 или более последовательно соеди­ненных диффузоров, принцип работы которой представлен на рис. 25. Диффузор представляет собой.цилиндро-коническую емкость, снабженную рубашкой. В центральную цилиндрическую часть аппарата помещают сухую или влажную поверхностную культуру и фиксируют ее двумя сетками снизу и сверху (см. рис. 26, а). Экстрагент подают в диффузор 1 снизу, обычно это вода стемпературой 22-28 °С, и заполняют диффузор полностью до уровня сливной трубы. Подача воды прекращается на определенное время, затем вновь включают подачу воды и с помощью свежей воды вытесняют экстрагент из диффузора 1 в диффузор 2 до его полного заполнения, и вновь вся система останавливается на определенное время и т.д. Таким образом все повторяется до тех пор, пока в последнем, восьмом диффузоре экстрагент простоит еще Т₈, т. е. если т = 30 мин, ^то %б_Щ будет 4 часа (0,5 ч ■ 8).

Рис. 25. Принципиальная схема работы диффузионной батареи система подачи воды; б — режим работы батареи в непрерывном процессе экстракции

После этого отбирают готовый экстракт. Непрерывность работы10-ти членной батареи поясняет рис. 26, б. После включения в работу 8-ми диффузоров в диффузоре 1 уже прошла 8-кратная эк­стракция, этот диффузор отключается для разгрузки, вода подается на диффузор 2, экстракт поступает в диффузор 9 заполненный свежей культурой, и съем экстракта через 30 минут наста­ивания производят с диффузора 9. К этому времени диффузор 1 разгружен и вымыт, диффузор 10 загружен свежей культурой, диффузор 2 отключен на разгрузку, вода подается на диффузор 3 и т.д.

Но эти установки: для экстрагирования БАВ из поверхностной культуры имеют сравнительно небольшую производительность, требуют больших затрат ручного труда, и в них наблюдаются сравнительно большие потери активности.

Поэтому постоянно ведутся исследования и поиск наиболее совершенной конструкции экстрак­торов, работающих в непрерывном режиме и с минимальной затратой ручного труда.

Жидкофазная центробежная экстракция наиболее часто используется в производствах антиби­отиков, в том числе при производстве наиболее крупнотоннажного из них — пенициллина. В про­изводстве пенициллина много стадий жидкофазной экстракции: сначала пенициллин из водной фазы переводят в органическую (бутилацетат), затем из органической фазы — опять в водную, за­тем опять в органическую и т.д.

Этот антибиотик в неионизированной форме хорошо растворяется в некоторых органических растворителях (бутилацетате или амилацетате). Растворимость его в таких растворителях почти в 100 раз больше, чем в воде. Диссоциированный же анион не имеет столь хорошей растворимости в органической фазе. Для перевода его в недиссоциированное состояние, нужно увеличивать конце­нтрацию ионов водорода в растворе, подкисляя его. Кроме того, помимо активного бензилпеницил­лина, экстрагируются формы, имеющие низкую активности, растворимость которых выше при pH 3,0-3,3. Понижая pH, можно предотвратить переход нежелательных форм пенициллина в бу- тилацетатный экстракт.

Таким образом, проводить экстракцию желательно при pH, равном 2,0. Однако бензилпени- цилин неустойчив и разрушается при низких значениях pH. Выход в максимально быстром про­ведении экстракции. Для этого процесс экстракции должен осуществляться в такой последова­тельности:

• подкисление водного раствора пенициллина;

• добавление к нему экстрагента — органической фазы;

• диспергирование фазы для обеспечения наибольшей поверхности раздела фаз и повыше­ния коэффициента распределения,

• интенсивное перемешивание для осуществления процесса собственно экстракции, причем время протекания процесса должно быть настолько малым, чтобы не успело проявиться разрушающее действие низких значений pH на водные растворы пеницил­лина;

• после завершения процесса экстракции — разделение водной и органической фаз.

Все эти операции быстро можно провести, только если:

• процесс проводится в непрерывном режиме;

• в качестве аппарата используется центробежный экстрактор.

Вот почему в биотехнологических процессах экстракция осуществляется в центробежных эк­стракторах, напоминающих по конструкции центробежные сепараторы. В них происходит эмуль­гирование фаз путем смесителя-инжектора, экстракция в центробежном поле и затем деэмульги­рование органических фаз. Кроме того, в многоступенчатых центробежных экстракторах обеспе­чивается еще противоточное движение фаз, создающее равномерную по ходу потока движущую си­лу массоотдачи.

Преимущества таких экстракторов — высокая производительность и возможность работы с ла­бильными продуктами.

Недостатки: высокие энергетические затраты, возможность проскока частично эмульгирован­ного слоя («третьего слоя»), что увеличивает потери целевого продукта.

Организация межфазной поверхности. При экстрагировании биомассы не все клетки оказыва­ются доступными для экстрагента. Кроме того, для повышения коэффициента массоотдачи важно повысить относительную скорость движения биомассы и жидкой фазы.

Для улучшения структуры межфазной поверхности часто из биомассы формируют специальной формы гранулы, называемые «лепесток». Так поступают при экстракции липидов из микробной би­омассы. Для этого сначала просто гранулируют биомассу, получая сферические гранулы. Затем эти

яг а Получение целевых препаратов БАВ

I И - ^Л -________ :-----------------------------------

лы пропускают через вальцы, получая сплющенные лепешки толщиной 0,2—0,3 мм — «лепес- Далее уже эти «лепестки» загружают в аппарат для экстрагирования, и при этом обеспечива­

йся более эффективная массоотдача.

Экстрагирование «суперкритическими» жидкостями. При выделении липидов и всякого рода неустойчивых, лабильных соединений, проводя экстрагирование, следует учитывать дальнейшие операции выделения. Поэтому часто используют легкокипящие соединения — спирт, гексан, аце­тон которые в дальнейшем удаляют путем выпаривания.

Но для выпаривания этих соединений требуются относительно высокие температуры, которые &югут повлиять на качество выделяемых биопродуктов. При этом также необходимы затраты энер­гии на испарение экстрагентов и их последующую конденсацию.

.Кажется очевидным,-что для решения этих проблем следовало бы брать в качестве растворите­лей жидкости, имеющие более низкую температуру кипения. Одной из таких жидкостей является дйоксид углерода. Правда, при атмосферном давлении температура его кипения довольно низка (ниже -50 ’С). Но с повышением давления температура кипения повышается.

Обычно плотности газа и жидкости резко различаются. Напри-мер, при +10 °С плотность жид­кости СОг составляет 0,86 г/см³, а газа — 0,14 г/см³. При 20 °С — соответственно 0,77 и 0,19 г/см³, _апри 30 °С — 0,59 и 0,35. А вот при 31,1 °С и давлении 7,3 МПа плотность жидкости и газа стано­вится равной. Если и температура, и давление выше своих критических значений, то образуется фаза — фаза «суперкритической» жидкости, обладающей свойствами, промежуточными между жидкостью и газом

Физические и диффузионные свойства «суперкритических» жидкостей находятся в диапазоне между значениями соответствующих свойств газов и истинных жидкостей и обычно весьма бла­гоприятны для их применения в качестве экстрагентов. В частности, очень низка их вязкость, что снижает Затраты на перекачивание. Кроме того, при работе на границе области критических зна­чений температуры и давления можно путем небольших температурных воздействий переводить «суперкритические» жидкости в газы и обратно в жидкости.

Существуют и другие вещества, имеющие критические температуры в областях, близких к нор­мальной температуре (табл. 2).

Таким образом, процесс выделения продукта проводится при обычной температуре и не требу- етгвыпарки для разделения продукта и растворителя-экстрагента.

... «Суперкритические», жидкости являются неполярными растворителями и лучше растворяют неполярные вещества. Ионизированные вещества в «суперкритических» жидкостях практически нерастворимы, хорошо растворяются углеводороды и растворимые в жирах органические соедине­ния — парафины, многие эфиры, лактоны и глицериды; многие лекарства, кофеин, никотин, сте­роиды и алкалоиды, вкусовые и ароматические компоненты.

’■ Таким образом, экстрагирование «супекритическими» жидкостями обладает определенными преимуществами, среди них:

• высокая энергетическая эффективность;

• низкие температуры;

• нетоксичные и недорогие растворители (экстрагенты);

• низкая вязкость, высокая диффузионная способность;

• силой растворителя можно управлять.

Недостатки:

• необходимо оборудование высокого давления;

• относительно низкая сила растворителя;

• плохие растворители для полярных соединений;

• недостаточно данных для надежного проектирования (все нужно проверять эксперимен тально).

Критическая температура и давление «су пер критических» экстрагентов