Немеханические методы
Сушка. Наиболее простой метод, который резко изменяет структуру клеточной оболочки. После сушки, в результате которой клетки не остаются живыми и теряют внутриклеточную влагу, в оболочке клетки появляется много «трещин».
Ресуспендирование высушенных клеток в водной фазе позволяет выделить внутриклеточные компоненты. Недостатком метода является то, что при горячей сушке денатурируются ферменты и инактивируются многие биологически активные вещества.Лизис. Разрушение, «разъединение» клеточной оболочки с помощью лизиса кажется наиболее привлекательным для решения задач выделения внутриклеточных продуктов. Методы лизиса можно подразделить на физические, химические и ферментативные в зависимости от характера воздействий, вызывающих лизис клеточной оболочки.
Физические методы лизиса включают в себя метод осмотического шока и метод попеременного замораживания — оттаивания.
Осмотический шок. По этому методу в суспензии сначала создается высокое осмотическое давление (например, с помощью 1 М глицеринового или 1 М сахарозного раствора). Затем производится резкое разбавление суспензии водой. При этом клетки разрушаются под действием высокого внутриклеточного осмотического давления. Подобным же образом действуют растворы солей.
Есть, например, такие микроорганизмы — галофилы, которые культивируются на высококонцентрированных солевых средах. По окончании процесса культивирования разбавление культуральной жидкости водой почти сразу приводит к лизису клеток. Это используется в технологии — не требуется специальных ухищрений по дезинтеграции клеток!
Замораживание—оттаивание. Известно, что замораживание используется в противоположных целях — для длительного хранения микроорганизмов в жизнеспособном состоянии. Но при этом и: замораживание, и оттаивание проводят в специальном, программированном режиме, препятствующем повреждению клеток.
При дезинтеграции, наоборот, используют режимы, способствующие повреждениям клеточных оболочек.Недостатками метода являются большая длительность и энергоемкость и к тому же невысокая степень дезинтеграции. Это не позволяет широко использовать данный метод в промышленном масштабе.
Химические способы лизиса предусматривают воздействия на клетку химических реагентов различной природы, которые приводят к деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизмов.
Обработка суспензии микроорганизмов такими реагентами, как щелочь, кислота, мочевина, аммиак, бутанол, толуол, пероксид водорода., детергенты, повышает проницаемость клеточных стенок, благодаря чему биополимеры выводятся из клеток в раствор. Для усиления действия возможно использование упомянутых реагентов в комплексе с повышением температуры, резким изменением величины pH.
Некоторые антибиотики, ингибирующие рост клеток микроорганизмов, оказывают литическое воздействие на клетки. Среди реагентов упоминают также глицерин, олеиновую кислоту, способствующие быстрому лизису клеток.
Эти способы имеют важный недостаток. Химические реагенты могут вступать в реакцию с извлекаемыми из клетки биополимерами и к тому же остаются в лизированной суспензии, откуда их потом трудно выделять.
Ферментативные способы лизиса. Использование биологических агентов для ферментативного лизиса клеточных оболочек является одним из наиболее перспективных методов.
Автолиз. Для разложения клеточных стенок собственными протеолитическими ферментами клетки необходимо сначала осуществить шоковое воздействие или величиной pH (обычно закислением), или температурой, или затравочной дозой таких реагентов, как толуол, хлороформ, этила- цетат, олеиновая кислота. Далее процесс автолиза протекает при температуре, свойственной данному виду микроорганизмов. Например, автолиз дрожжей происходит при 45-50 °С. Надо отметить, что это довольно длительный процесс (12-24 ч).
Ферментолиз. Недостатки автолиза привели к использованию интродуцируемых в суспензию внеклеточных ферментов, вызывающих лизис клеточной стенки.
Исходя из рассмотренного ранее состава клеток, такими ферментами могут быть протеазы, гликаназы, манназы и иногда лизоцим, представляющий собой комплекс различных ферментов. Эффективно применение иммобилизованных ферментов, которые можно использовать многократно.Получаемые при автолизе и ферментолизе растворы часто содержат легкоусвояемые вещества (белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и др.). Поэтому автолизаты и ферментолизаты — не просто полупродукт для выделения внутриклеточных составляющих, но также могут быть хорошим кормовым продуктом. Он особенно подходит для молодняка рыб и животных, которые еще не приспособились своими ферментами переваривать клеточные оболочки и разрушать их.
Клеточные оболочки, также являющиеся продуктом процесса дезинтеграции, могут быть отделены от раствора, высушены, после чего их вполне можно использовать как хороший сорбент ддя вредных примесей в пищевых продуктах или как тот же корм для животных.
Добавление пенициллина. Биохимическая основа действия пенициллина на микробные клетки — это торможение синтеза нового материала клеточной стенки. В результате стенка истончается за счет собственного всегда идущего автолиза и становится проницаемой для внутриклеточных биополимеров.
Фаголизис. Известно «вирусное заболевание» микробных культур, вызываемое фагом. Его отличительным свойством является как раз лизис микробных клеток, однако этот метод не применим в производстве из-за высокого риска заражения фагом производственных ферментеров.
В промышленных условиях наиболее перспективно применение методов лизиса — с использованием либо химических реагентов, либо ферментов. Другие методы имеют лишь вспомогательное значение для опытов в лаборатории.
3.4.