ВВЕДЕНИЕ

Изучение биохимических механизмов развития окислительного стресса весьма актуально, так как затрагивает большое число заболеваний и патологий, но - необычайно сложно, так как требует решения комплекса проблем методического и теоретического плана (Е.Б.

Значимость исследований окислительной модификации белков в комплексе с уровнем веществ средней молекулярной массы обусловлена тем, что данные биохимические тесты - маркеры выраженности эндотоксикоза, чувствительные к изменению степени окислительного стресса. (Р.Н. Белоногов и соавт., 2009; Т.В. Копытова и соавт., 2009; Н.Ю. Келина и соавт., 2012; О. Халдун и соавт., 2012; Н.В. Безручко и соавт., 2013; Г.К. Рубцов и соавт., 2013.) Изучение их в совокупности, в одной пробе биологической среды, позволит увеличить информативность каждого из этих параметров и снизить расход используемого материала, что особенно важно в клинической биохимии.

Метод оценки окислительной модификации белков (ОМБ) в совокупности с уровнем молекул средней массы (МСМ) может быть реализован в соответствии с авторским способом (Г.К. Рубцов и соавт., 2012). Метод предполагает определение в одной и той же пробе биологического материала и уровня МСМ, и величин ОМБ. Для этого проводят осаждение белков трихлоруксусной кислотой. Надосадочную жидкость используют для регистрации экстинкций МСМ (при 254 нм), а осадок - для определения величин ОМБ (при 356 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм). Уровень ОМБ изучают в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-

ДФГ) с образованием карбонильных производных белков (2,4- динитрофенилгидразонов). Регистрация уровней ОМБ

спектрофотометрически на четырех длинах волн позволяет выявить уровни 2,4-динитрофенилгидразонов различной природы: при 356 нм - алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 370 нм - алифатические кетондинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 430 и 530 - алифатические

альдегиддинитрофенилгидразоны и кетондинитрофенилгидразоны основного характера (Е.Е.

Для изучения спонтанной и инициированной (металлкатализируемой) окислительной модификации белков и уровня молекул средней массы удобно использовать модельные биологические системы (МБС), например МБС желточных липопротеидов (ЖЛП).

Металлкатализируемое окисление представляет собой местный специфический процесс, протекающий в нормально функционирующем организме, и его уровень является важным прогностическим показателем. Т.е. диагностическое значение имеет не только определение спонтанной ОМБ, которая указывает на количество модифицированных аминокислот, но и металлиндуцированная деструкция белковых молекул. Индуцированная ОМБ позволяет выявить как изменения аминокислот, входящих с состав полипептидной цепи, так и модификации, связанные с конформацией молекулы и состоянием белкового окружения. (М.В. Ведунова и соавт., 2010.)

В связи с этим в работе проведены серии наблюдений не только в условиях спонтанного, но и в условиях металлкатализируемого окисления, в качестве которого было применено Бе²⁺-индуцированное окисление. Выбор способа индуцирования ОМБ в пуле МСМ с помощью ионов Fe²⁺ обусловлен следующим.

Введение в систему ионов Fe²⁺сопровождается ускорением процессов свободно-радикального окисления, уровень аутоокисления плазмы крови и суспензии желточных липопротеидов крайне мал, причем плазма крови, по сравнению с желточными липопротеидами, в присутствии ионов Fe²⁺окисляется намного меньше (Г.И. Клебанов и соавт., 1988). Г.И. Клебанов и соавт. (1988) предположили, что в самом общем случае ингибирование плазмой крови пероксидации липидов желточных липопротеидов в присутствии ионов Fe²⁺обусловлено наличием в плазме крови антиоксидантов и (или) веществ, обеспечивающих окисление и связывание ионов Fe²⁺.

С этих позиций представляют практический интерес разработка и оптимизация методического обеспечения исследования данных параметров (МСМ и ОМБ) в комплексе, в одной пробе биологической среды.

Наше исследование ориентировано на изучение биологического значения параметров спонтанной и Fe²⁺-инициированной окислительной модификации белков и молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов. Это направлено на решение задачи повышения информативности исследуемых биохимических тестов путем исследования их в комплексе - в одной и той же пробе, снизив расход биологического материала, имеющей ключевое значение для развития медицинской биохимии и ее клинического раздела.

Необходимость изучения как спонтанной, так и индуцируемой ионами металлов ОМБ, обусловлена тем, что это дает возможность определить чувствительность данной модельной биологической системы к

изменению условий процессов свободно-радикального окисления. В нашей работе в основе применяемого метода регистрации уровня ОМБ использовалась реакция с 2,4-динитрофенилгидразином, в процессе которой могут образовываться динитрофенилгидразоны альдегидной и кетонной природы. Изучение инициированной ОМБ проводилось в модельных биологических системах в присутствии ионов железа (Fe²⁺).

Цель исследования: предложить маркерные параметры оценки уровня спонтанной и Fe²⁺-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующие с уровнем молекул средней массы, и обосновать диапазоны их чувствительности к изменению условий процессов свободно-радикального окисления на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Задачи исследования:

1. Изучить спонтанную и Fe²⁺-инициированную окислительную

модификацию белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов, продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы).

2. Исследовать спонтанную и Fe²⁺-инициированную окислительную модификацию белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов при добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

3. Определить особенности спонтанной и Fe²⁺-инициированной окислительной модификации белков и уровней молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов при

одновременном добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

4. Выявить возможности комплексного использования маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Fe^-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Научная новизна.

Предложен способ определения уровня окислительной модификации белков и молекул средней массы (патент на изобретение Российской Федерации № 2525437, в соавторстве).

Исследованы спонтанная и Fe²⁺-инициированная окислительная модификация белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе, в качестве которой были выбраны желточные липопротеиды. Соответствующие тесты определены в продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы).

Изучены особенности проанализированной модельной биологической системы по уровню окислительной модификации белков различного характера, регистрируемой по изменению концентрации карбонильных соединений, реагирующих с 2,4-динитрофенилгидразином, в условиях спонтанного и Fe²⁺-индуцированного окисления. Выявлено, что наиболее показательна регистрация уровней ОМБ при длинах волн 430 и 530 нм, на которых отмечается образование алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов и кетондинитрофенилгидразонов основного характера.

Установлены возможности комплексного использования изученных маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Fe^-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Практическая значимость работы и внедрение в практику.

Работа является фрагментом научных исследований Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет». Научно-практическим значением данной работы является повышение информативности биохимических тестов окислительной модификации белков и молекул средней массы: предложена методика исследования их в комплексе, в одной и той же пробе, апробированная на модельной биологической системе. Эта методика может быть рекомендована к практическому использованию.

Полученные результаты внедрены с 2013 г. в учебный процесс на кафедре биохимии Пензенского государственного университета. Издано учебное пособие по медицинской биохимии (в соавторстве): «Медицинская биохимия: Учебное пособие. - Издательство Пензенского государственного университета» (2013). (Данное учебное пособие было представлено на IV Дальневосточный региональный конкурс изданий высших учебных заведений «Университетская книга - 2013» и награждено грамотой: выписка из протокола заседания жюри № 4 от 01.10.2013.)

Получен патент на изобретение Российской Федерации (№ 2525437, в соавторстве) по способу определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы.

Положения, выносимые на защиту.

Fe²⁺-инициированная окислительная модификация белков на модельной биологической системе желточных липопротеидов, продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающие антиоксидантным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы) наиболее показательно изменялась, по отношению к спонтанному окислению, при 430 нм и 530 нм (длинах волн, проявивших себя как маркерные).

Установлены возможности комплексного использования маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Fe^-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Выявлены тенденции увеличения величин окислительной модификации белков, регистрируемых при 430 нм и 530 нм, и молекул средней массы при Fe²⁺-индуцированном окислении, по отношению к спонтанному окислению, на модельной биологической системе желточных липопротеидов при добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

Показана перспективность комплексного использования модельной биологической системы желточных липопротеидов при одновременном добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы) при спонтанном и Fe²⁺- индуцированном окислении: «желточные липопротеиды + продукты пчеловодства или сыворотка крови крыс», «желточные липопротеиды + продукты пчеловодства + сыворотка крови крыс».

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совещаниях кафедры биохимии Пензенского государственного университета, а также на:

■ XI межвузовской биохимической научно-практической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2012, 2013);

■ V Беломорском симпозиуме (Архангельск, 2013);

■ V ежегодной конференции «Балтийский форум. Актуальные проблемы анестезиологии и реаниматологии» (Светлогорск, 2012);

■ XVII Форума «Национальные дни лабораторной медицины России - 2013» (Москва, 2012, 2013);

■ Девятой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 2012, 2013).

Публикации результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе двух на международных научно-практических конференциях, 9 статей в российских рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

Работа иллюстрирована 8 таблицами, 31 рисунком.

Список литературы включает 189 источников (140 отечественных, 49 зарубежных).