Актуальность проблемы.

Изучение биохимических механизмов развития окислительного стрес­са весьма актуально, так как затрагивает большое число заболеваний и пато­логий, но - необычайно сложно, так как требует решения комплекса проблем методического и теоретического плана (Е.Б.

Значимость исследований окислительной модификации белков в ком­плексе с уровнем веществ средней молекулярной массы обусловлена тем, что данные биохимические тесты - маркеры выраженности эндотоксикоза, чув­ствительные к изменению степени окислительного стресса. (Р.Н. Белоногов и соавт., 2009; Т.В. Копытова и соавт., 2009; Н.Ю. Келина и соавт., 2012; О. Халдун и соавт., 2012; Н.В. Безручко и соавт., 2013; Г.К. Рубцов и соавт., 2013.) Изучение их в совокупности, в одной пробе биологической среды, позволит увеличить информативность каждого из этих параметров и снизить расход используемого материала, что особенно важно в клинической биохи­мии.

Метод оценки окислительной модификации белков (ОМБ) в совокуп­ности с уровнем молекул средней массы (МСМ) может быть реализован в соответствии с авторским способом (Г.К. Рубцов и соавт., 2012). Метод предполагает определение в одной и той же пробе биологического материала и уровня МСМ, и величин ОМБ. Для этого проводят осаждение белков три­хлоруксусной кислотой. Надосадочную жидкость используют для регистра­ции экстинкций МСМ (при 254 нм), а осадок - для определения величин ОМБ (при 356 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм). Уровень ОМБ изучают в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДФГ) с образованием карбонильных производных белков (2,4-динитрофенилгидразонов). Регистрация уровней ОМБ спектрофотометрически на четырех длинах волн позволяет выявить уровни 2,4-динитрофенилгидразонов различной природы: при 356 нм - али­фатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 370 нм - алифатические кетондинитрофенилгидразоны нейтрального харак­тера, при 430 и 530 - алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны и ке- тондинитрофенилгидразоны основного характера (Е.Е.

Для изучения спонтанной и инициированной (металлкатализируемой) окислительной модификации белков и уровня молекул средней массы удоб­но использовать модельные биологические системы (МБС), например МБС желточных липопротеидов (ЖЛП).

Металлкатализируемое окисление представляет собой местный специ­фический процесс, протекающий в нормально функционирующем организ­ме, и его уровень является важным прогностическим показателем. Т.е. диа­гностическое значение имеет не только определение спонтанной ОМБ, кото­

рая указывает на количество модифицированных аминокислот, но и метал- линдуцированная деструкция белковых молекул. Индуцированная ОМБ поз­воляет выявить как изменения аминокислот, входящих в состав полипептид- ной цепи, так и модификации, связанные с конформацией молекулы и состо­янием белкового окружения. (М.В. Ведунова и соавт., 2010.)

В связи с этим в работе проведены серии наблюдений не только в условиях спонтанного, но и в условиях металлкатализируемого окисления, в качестве которого было применено Ре²⁺-индуцированное окисление. Выбор способа индуцирования ОМБ в пуле МСМ с помощью ионов Fe²⁺ обусловлен следующим.

Введение в систему ионов Fe²⁺сопровождается ускорением процессов свободно-радикального окисления, уровень аутоокисления плазмы крови и суспензии желточных липопротеидов крайне мал, причем плазма крови, по 2+ сравнению с желточными липопротеидами, в присутствии ионов Fe окис­ляется намного меньше (Г.И. Клебанов и соавт., 1988). Г.И. Клебанов и со­авт. (1988) предположили, что в самом общем случае ингибирование плаз­мой крови пероксидации липидов желточных липопротеидов в присутствии ионов Fe²⁺обусловлено наличием в плазме крови антиоксидантов и (или) веществ, обеспечивающих окисление и связывание ионов Fe²⁺.

С этих позиций представляют практический интерес разработка и оп­тимизация методического обеспечения исследования данных параметров (МСМ и ОМБ) в комплексе, в одной пробе биологической среды.

Наше исследование ориентировано на изучение биологического значе­ния параметров спонтанной и Fe^-инициированной окислительной модифи­кации белков и молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов. Это направлено на решение задачи повышения информативности исследуемых биохимических тестов путем исследования их в комплексе - в одной и той же пробе, снизив расход биологического ма­териала, имеющей ключевое значение для развития медицинской биохимии и ее клинического раздела.

Таким образом, необходимость изучения как спонтанной, так и инду­цируемой ионами металлов ОМБ, обусловлена тем, что это дает возможность определить чувствительность модельной биологической системы к измене­нию условий процессов свободно-радикального окисления. В нашей работе в основе применяемого метода регистрации уровня ОМБ использовалась реак­ция с 2,4-динитрофенилгидразином, в процессе которой могут образовы­ваться динитрофенилгидразоны альдегидной и кетонной природы . Изучение инициированной ОМБ проводилось в модельной биологической системе в присутствии ионов железа (Fe²⁺).

Цель исследования: предложить маркерные параметры оценки уровня спонтанной и Fe^-инициированной окислительной модификации белков,

коррелирующие с уровнем молекул средней массы, и обосновать диапазоны их чувствительности к изменению условий процессов свободно­радикального окисления на модельной биологической системе желточных липопротеидов.