ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Забор крови производился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия.

1.Определение концентрации комплексов тромбин-антитромбин (ТАТ) с помощью фирменного набора Enzygnost-TAT (Behringwerke, Germany). Принцип исследования заключается в определении концентрации комплексов ТАТ иммуноферментным методом в плазме крови с помощью

«сандвич» - техники.

Во время первой инкубации находящиеся в исследуемом образце комплексы ТАТ связываются с антителами к антитромбину, фиксированными на поверхности пластиковой пробирки. В ходе дальнейшей реакции при добавлении антител к человеческому AT III, конъюгированных с пероксидазой, последние связываются со свободными (еще не связанными) детерминантами AT III комплексов ТАТ. Избыток антител, конъюгированных с пероксидазой, удаляется при промывании. Затем измеряется энзиматическая активность соединения. Энзиматические преобразования перекиси водорода и хромогена тормозятся путем добавления в пробирку разведенной серной кислоты. Затем фотометрически измеряется интенсивность окрашивания, которая пропорциональна концентрации комплексов ТАТ. Клиническое значение определения концентрации комплексов ТАТ связано с возможностью ранней диагностики тромбофилического состояния, так как комплексы ТАТ являются ранними маркерами тромбофилии и начала внутрисосудистого свертывания крови.

2. Метод оценки внутрисосудистого тромбообразования - определение D-димера с помощью латекс-теста Dimertest (Agen, Australia), который основан на взаимодействии высокоспецифичных антител к D-димеру, фиксированных на латексных частицах. D-димер характеризует перекрестную полимеризацию фибрина в процессе внутрисосудистого свертывания крови; является одним из наиболее специфических тестов диагностики ДВС-синдрома, тромбофилии и тромбоза.

3. Исследование плазменного звена системы гемостаза.

а) Определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), характеризующего суммарную активность факторов

внутреннего пути свертывания (кроме FVII и FVIII) в условиях стандартной активации факторов контакта (FXII и FXI) каолином и стандартного содержания фосфолипидов (частичный тромбопластин) с использованием коммерческих наборов Stago, Франция.

б) оценка показателей гемостаза на приборе тромбоэластограф

«Hellige» (Germany): “r+k” (хронометрический показатель), “ma” (максимальная амплитуда) «ИТП» (индекс тромбодинамического потенциала) с целью оценки хронометрических и структурных параметров коагуляции.

4. Определение количества тромбоцитов.

Контроль количества тромбоцитов в периферической крови проводился на автоматическом счетчике «Тrombocounter», Франция.

5. Исследование функциональной активности тромбоцитов.

Исследование агрегации тромбоцитов проводили на агрегометре Рауtоn (США) по методу Вогn (106), с графической регистрацией интенсивности и динамики агрегации тромбоцитов при перемешивании их со стимуляторами агрегации в кювете агрегометра. Принцип метода основан на фотоэлектрической регистрации динамики изменения светопропускания (оптической плотности) образца плазмы богатой тромбоцитами при перемешивании с индукторами агрегации: раствор аденозиндифосфата (АДФ) конечной концентрации 1´10^-3М, 1´10^-5М, 1´10^-7М; суспензия коллагена, раствор адреналина - 1´10^-3М; арахидоновой кислоты 1´10^-5М.

Предварительная оценка агрегатометра проводилась в зависимости от типов кривых: "необратимая агрегация", "обратимая агрегация" (дезагрегация) и двухфазная агрегация (рис. 6). Количественная оценка параметров агрегации тромбоцитов проводилась после предварительной оценки по типам кривых, с помощью вычисления следующих параметров агрегации: T_ma, T_ва,Т_ДА,и t _лп (рис.7).

Характеристика параметров агрегации: Т_ма (%) - величина максимальной

агрегации, определяется отношением величины изменения светопропускания образца исследуемой плазмы к величине интервала светопропускания от 0% до

56

100%, характеризует интенсивность агрегации. Т_ва (%) - величина вторичной агрегации, определяется отношением изменения светопропускания образца плазмы на этапе вторичной агрегации к величине интервала от 0% до светопропускания 100%, характеризует интенсивность вторичной агрегации (только для двухфазных кривых агретограммы). Т_да (%) - величина дезагрегации, определяется отношением изменения светопропускания образца исследуемой плазмы на этапе образования дезагрегации (только для обратимой агрегации). t_лп (сек) - латентный период коллаген- агрегации и агрегации под воздействием арахидоновой кислоты, от момента добавления стимулятора до начала реакции высвобождения эндогенных стимуляторов и синтеза ТхАз, характеризует время начала реакции высвобождения эндогенных стимуляторов агрегации и синтеза циклических эндопероксидов - простагландинов и тромбоксана А₂ в тромбоцитах.

Т

1 2 3

t

Рисунок 4. Типы кривых агрегатограммы.

1- необратимая агрегация; 2-двухфазная агрегация; 3- обратимая (дезагрегация) агрегация.

ma

t Момент добавления индуктора агрегации

Рисунок 5.

6. Определение антифосфолипидных антител. Основные принципы их выявления.

Выявление антифосфолипидных антител (АФА) основывалось на рекомендациях Международного Общества по тромбозу и гемостазу, опубликованных в материалах XVI Всемирного конгресса по тромбозу и гемостазу (Флоренция, Италия; июль 1997 г.) и XV Международного конгресса по тромбозу (Анталия, Турция; октябрь 1998 г.). Эти диагностические подходы стали использоваться при диагностике АФС на кафедре акушерства и гинекологии м/п факультета ММА им. И. М. Сеченова (зав. кафедрой профессор Макацария А. Д.) с сентября 1997г.

Определение волчаночного антикоагулянта (ВА) включало 3 этапа:

1) скрининг – тесты

2) коррекционная проба

3) подтверждающая проба с фосфолипидами

Одновременно определение антикардиолипиновых антител (АКА) осуществлялось ELISA - методом и включало выявления изотипа и титра антител.

Варианты полученных результатов были следующими: АКА - ВА -

АКА + ВА +

АКА + ВА - АКА - ВА +

Особое место в исследовании занимало выявление ВА как фактора тромбофилии. При этом

1) скрининговые методы осуществлялись с помощью следующих фосфолипид-зависимых тестов:

- АЧТВ с низким содержанием фосфолипидов (РТТ - LA; STAGO, France).

- время разведенного яда гадюки Рассела (Stago, France; dRVVT)

- протромбиновое время с разведенным тромбопластином (TTI, STAGO, France).

Если фосфолипид-зависимые тесты были нормальными, то скрининговая проба на выявление ВА считалась отрицательной.

Удлинение фосфолипид-зависимых тестов (одного или нескольких)

диктовало необходимость проведения коррекционной пробы:

2) коррекционная проба осуществлялась путем смешивания исследуемой плазмы с нормальной плазмой в соотношении 1:1; 1:4 и 4:1 соответственно с целью исключения дефицита факторов.

Если при добавлении нормальной плазмы фосфолипид-зависимые тесты оставались удлиненными, проводились тесты, подтверждающие направленность циркулирующих ингибиторов против фосфолипидов.

3) подтверждающая проба - для этой цели использовались лизаты тромбоцитов (PNP, STAGO, France) и гексагональный фосфолипид (Staclot, Stago, France).

Укорочение АЧТВ до нормы свидетельствовало об антифосфолипидной природе циркулирующих ингибиторов.

На IV этапе в ряде случаев проводилось дифференцирование других причин нарушения свертываемости крови - дефициты отдельных факторов и другие специфические антикоагулянты.

Ниже приводится алгоритм процедуры определения ВА при использовании разных фосфолипид- зависимых скринирующих тестов (рис. 8).

Мы считаем крайне важным правильную интерпретацию результатов исследования и исключение ложноположительных результатов. Поэтому необходимо учитывать, что

1) удлинение АЧТВ и каолинового времени может быть при:

- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;

- дефиците факторов внутреннего пути свертывания;

- циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;

- дефиците витамина К как следствия мальабсорбции и длительной антибиотикотерапии;

- механической желтухе;

- коагулопатии потребления;

-гиперфибринолизе.

Рисунок 6. Алгоритм определения ВА. а) с использованием АЧТВ

АЧТВ удлинено Тромбиновое время

нормальное удлинено

коррекционая проба нейтрализация гепарина

коррекция

(дефицит факторов)

нет коррекции

нет коррекции

(аномалии фибриногена)

коррекция

(гепарин)

подтверждающая проба с фосфолипидами

нет коррекции

(специфический ингибитор)

коррекция

(волчаночный антикоагулянт)

б) помощью времени разведенного яда гадюки Рассела (dRVVT)

dRVVT удлинено коррекционная проба

нет коррекции коррекция

ингибиторы дефицит факторов (V или Х)

подтверждающая проба с фосфолипидами

нет коррекции коррекция ингибитор фактора V волчаночный антикоагулянт

2) удлинение dRVVT может быть при:

- циркуляции ВА;

- циркуляции ингибитора фактора V;

- дефиците факторов V, Х и I;

- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов.

3) удлинение протромбинового времени в тесте с разведенным тромбопластином может быть при:

- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;

- дефиците факторов внешнего пути свертывания;

- циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;

- дефиците витамина К;

- механической желтухе;

- коагулопатии потребления.

Также проводилось определение концентрации АФА (IgA, IgG, IgM) иммуноферментным методом (Stago, Asserachrom APA). Средние титры – 20-40 GPlU/ml; высокие - > 40.

7. Всем пациенткам с выявленной мутацией МТHFRС677Т

проводилось определение концентрации гомоцистеина в плазме крови,

иммуноферментным методом с использованием реактивов Axis^® фирмы Axis- Shield AS, Норвегия на приборе ANТОS 2020, США (табл. 11).

Таблица 11. Определение степени гипергомоцистеинемии.

8. Глобальная оценка функционирования системы протеина С осуществлялась коагулометрическим методом с использованием коммерческих наборов «Парус»-тест фирмы «Технология-Стандарт», Барнаул, Россия на приборе «START 4» (Stago, Франция).

9. Уровни PAI-1, АТ III и протеина С определялись методом синтетических хромогенных субстратов Stago, Франция на спектрофотометре с длиной волны 405 нм на приборе ST 88 Diagnostica Stago.

10. Выявление генетически обусловленных форм тромбофилии Молекулярный анализ генетических дефектов гемостаза FV Leiden

/1691G-A/, мутации гена фолатзависимого фермента метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T, а также мутация в гене Pt G20210A выполнялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Основные этапы выявления генетических дефектов гемостаза включали: -выделение ДНК;

-амплификацию (методом ПЦР);

-рестрикцию.

Молекулярный анализ генетических дефектов FVLeiden /1691G-A/, MTHFRC677T, Pt G20210А выполнялся постановкой полимеразной цепной

реакции. Этот метод амплификации ДНК in vitro обеспечивает выявление

даже незначительных изменений в генах. Принцип ПЦР заключается в циклической денатурации с образованием матричных цепей, гибридизации олигонуклеотидов, комплементарных синтезируемой ДНК и пр.

1.Определение мутации в гене С677Т в гене 5,10- метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) человека методом ПЦР.

Мутация С677Т в гене MTHFR человека представляет собой замену остатка цитозина в положении 677 на остаток тимина.

В результате мутации изменяется последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента, что делает его термолабильным, приводит к дефициту цитоплазматической MTHFR и повышению уровня гомоцистеина в плазме крови из-за подавления его метаболизма. С помощью ПЦР производится амплификация участка ДНК обследуемого пациента, изменяемого под действием мутации. При этом содержание амплифицируемого фрагмента ДНК в пробе увеличивается в ~10⁸ раз по сравнению с исходным. Процесс амплификации совершается при повторных циклах температурной денатурации ДНК, отжига олигонуклеотидных праймеров на комплементарных последовательностях ДНК и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров термостабильной ДНК-полимеразой. Мутация С677Т приводит к образованию нового сайга рестрикции для рестриктазы HinfI. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте мутантный, но не нормальный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой HinfI и продукты реакции анализируют электрофорезом в агарозном геле. При наличии мутации обнаруживают образование двух низкомолекулярных полос, образовавшихся под действием фермента. При этом полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной формы мутации C677Т, а частичное - гетерозиготной (рис. 8).

Продукты ПЦР становятся видимыми в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием благодаря их флюоресценции в ультрафиолетовом свете. В результате полимеразной цепной реакции (38

циклов) образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой HinfI не сопровождается его расщеплением при отсутствии мутации С677Т (дорожки 2 и 5 рис. 9), полное расщепление с образованием фрагментов ДНК длиной 116 и 79 пар нуклеотидов (дорожка 8), происходит при наличии гомозиготной формы мутации и при гетерозиготной мутации - частичное ращепление (дорожки 1, 3, 4, 6, 7, 9).

Рисунок 7. Молекулярный анализ мутации MTHFRC677T.

2. Определение мутации в гене фактора V Leiden свертывающей системы крови методом полимеразной цепной реакции.

Мутация Leiden в гене фактора V представляет собой замену остатка аденина в положении 1691 на остаток тимина. В результате мутации происходит замена Arg-506®Gln в полипептидной цепи FV. В результате ПЦР амплифицируется участок исследуемой ДНК, измененный под действием мутации. Мутация Leiden нарушает сайт рестрикции для рестриктазы Мп1. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой Мп1. При отсутствии мутации после электрофореза обнаруживают две низкомолекулярные полосы, образовавшиеся под действием фермента. Полная устойчивость продукта ПЦР к рестриктазе свидетельствует о

наличии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации, а частичная – гетерозиготной формы (рис. 10).

Продукты ПЦР обнаруживаются в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. При проведении ПЦР в пробах, содержащих ДНК человека, образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой MnI сопровождается его полным расщеплением при отсутствии мутации Leiden. Расщепление отсутствует при наличии гомозиготной формы (дорожки 3 и 5, рис. 10), при гетерозиготной форме мутации – частичное расщепление (дорожки 7 и 13).

Рисунок 8. Молекулярный анализ мутации FVLeiden /1991G-A/.

3. Определение мутации G20210А в гене протромбина методом полимеразной цепной реакции.

Мутация PtG20210А представляет собой замену остатка гуанина в положении 20210 на остаток аденина, локализованного в его концевой некодирующей части. В результате мутации не изменяется последовательность аминокислот полипептидной цепи протромбина, однако увеличивается стабильность его м-РНК, что сопровождается повышением уровня синтеза протромбина и его концентрации в плазме крови. Мутация PtG020210А нарушает в ПЦР- продукте искусственный сайт рестрикции для рестриктазы Таq I, недостающие нуклеотиды которого вводятся в ПЦР- продукт с помощью одного из праймеров. Поэтому рестриктаза может

расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный амплифицированный фрагмент ДНК. При наличии гомозиготной мутации исходный продукт ПЦР не расщепляется ферментом. Полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует об отсутствии мутации PtG20210А в анализируемой ДНК, а частичное - гетерозиготной формы мутации (рис. 11).

Продукты ПЦР обнаруживают в 4% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете.

Хотя в мировой практике описывается гомозиготная форма мутации PtG20210А, нами были выявлены преимущественно гетерозиготные формы.

Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой TaqI сопровождается его полнымрасщеплением пр отсутствии мутации, частичным при наличии гетерозиготной мутации(дорожки 1,4 и 8).

Рисунок 9. Молекулярный анализ мутации PtG20210A.

В процессе ПЦР-диагностики полиморфизма GP Ia использовалась рестриктаза HinfI, GP IIIa «1565 Т/С» - MspI, фибриногена «455 G/A» и рецептора ангиотензина II типа 1 «1166 А/С» – HaeIII, PAI-1 «675 4G/5G» – Bsc4I.