Исследование системы гемостаза.

Забор крови производился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия.

1.Исследование плазменного звена системы гемостаза. а) определение активированного частичного

тромбопластинового времени (АЧТВ), характеризующего суммарную активность факторов внутреннего пути свертывания (кроме фVII и фVIII) в условиях стандартной активации факторов контакта (фXII и фXI) каолином и стандартного содержания фосфолипидов (частичный тромбопластин) с использованием коммерческих наборов Stago, Франция.

б) оценка показателей гемостаза на приборе тромбоэластограф «Helliger» (Германия): “r+k” (хронометрический показатель), “ma” (максимальная амплитуда), “ИТП” (индекс тромбодинамического потенциала) с целью оценки хронометрических и структурных параметров коагуляции.

2. Метод оценки внутрисосудистого тромбообразования .

Определение D-димера с помощью латекс-теста Dimertest (Agen, Australia), который основан на взаимодействии высокоспецифичных антител к D-димеру, фиксированных на латексных частицах. D-димер характеризует перекрестную полимеризацию фибрина в процессе внутрисосудистого свертывания крови; является одним из наиболее специфических тестов диагностики ДВС- синдрома, тромбофилии и тромбоза.

3. Определение количества тромбоцитов.

Контроль количества тромбоцитов в периферической крови проводился на автоматическом счетчике “Trombocounter”, Франция.

4. Исследование функциональной активности тромбоцитов.

Исследование агрегации тромбоцитов проводили на агрегометре Payton (США) по методу Born, с графической регистрацией интенсивности и динамики агрегации тромбоцитов при перемешивании их со стимуляторами агрегации в кювете агрегометра. Принцип метода основан на фотоэлектрической регистрации динамики изменения светопропускания (оптической плотности) образца плазмы богатой тромбоцитами при перемешивании с индукторами агрегации: раствор аденозиндифосфата (АДФ) конечной концентрации 1?10 ˉ?М, 1?10 ˉ5М, 1?10 ˉ7М; суспензия коллагена, раствор адреналина -1?10 ˉ?М; раствор арахидоновой кислоты 1?10 ˉ5М.

Предварительная оценка агрегатометра проводилась в зависимости от типов кривых: «необратимая агрегация»,

«обратимая агрегация» (дезагрегация) и двухфазная агрегация. Количественная оценка параметров агрегации тромбоцитов проводилась после предварительной оценки по типам кривых, с помощью вычисления следующих параметров агрегации: Тма, Тва, tлп.

Характеристика параметров агрегации: Тма (%) – величина максимальной агрегации, опредляется отношением величины изменения светопропускания образца исследуемой плазмы к величине интервала светопропускания от 0% до 100%, характеризует интенсивность агрегации. Тва (%) – величина вторичной агрегации, определяется отношением изменения светопропускания образца плазмы на этапе вторичной агрегации к величине интервала от 0% до светопропускания 100%, характеризует интенсивность вторичной агрегации (только для двухфазных кривых агргатограммы). Тда (%) – величина дезагргации, определяется отношением изменения светопропускания образца исследуемой плазмы на этапе обратимой дезагрегации (только для обратимой агрегации). Tлп (сек) – латентный период коллаген-агрегации и агрегации под воздействием арахидоновой кислоты, от момента добавления стимулятора до начала реакции высвоюлждения эндогенных стимуляторов агрегации и синтеза циклических эндопероксидов – простагландинов и тромбоксана А2 в тромбоцитах.

5. Определение антифосфолипидных антител.

Основные принципы их выявления.

Выявление антифосфолипидных антител (АФА) основано на рекомендациях Международного Общества по тромбозу и гемостазу, опубликованных в материалах XVI Всемирного конгресса по тромбозу и гемостазу (Флоренция, Италия, июль 1997 г.) и XV Международного конгресса по тромбозу (Анталия, Турция, октябрь, 1998 г.). Эти диагностические подходы стали использоваться при диагностике АФС на кафедре акушерства и гинекологии МПФ ММА им. И.М. Сеченова (зав.каф. профессор А.Д. Макацария) с сентября 1997 г.

Антифосфолипидные антитела включают в себя гетерогенную группу аутоантител, первично описанные как антитела против различных отрицательно заряженных фосфолипидов, например, кардиолипин. В последнее время выяснилось, что эти антитела оказались антителами против комплексов, состоящих из фосфолипидов и фосфолипидсвязанных белков, так называемых протеин- кофакторов. Такими белками-кофакторами являются β2- гликопротеин I, протромбин, аннексин V, протеин С, протеин S, тромбомодулин, высоко- и низкомолекулярные кининогены. Этот список постоянно пополняется. Присутствие кофактора β2-гликопротеина I усиливает связывание антител с фосфолипидами, поэтому стандартные ИФА (ELISA) тесты обычно покрыты смесью фосфолипидов и β2-гликопротеина I.

В нашем исследовании мы определяли антитела ИФА (ELISA) ко всему спектру фосфолипидов мембраны

человеческих клеток (кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, сфингомиелин), а также антитела к протеинам-кофакторам (β2-гликопротеин I, протромбин, аннексин V). Определение всего профиля антифосфолипидных антител значительно увеличивает чувствительность и специфичность диагностики АФС по сравнению с определением только антикардиолипиновых антител.

6. Определение волчаночного антикоагулянта.

Особое место в исследовании занимало выявление ВА как фактора тромбофилии.

В связи с известной гетерогенностью антифосфолипидных антител, лабораторная диагностика АФС включает в себя определение самих антифосфолипидных антител, определение антител к кофакторам, а также коагуляционные тесты для выявления волчаночного антикоагулянта. Люпус-антикоагулянт, который фактически является смесью антифосфолипидных антител, определяется методом, связанном на удлинении времени свертывания.

Определение волчаночного антикоагулянта (ВА) включает 3 этапа:

фосфолипидами.

При этом

cкрининг-тесты коррекционная проба

подтверждающая проба с

1) скрининговые методы осуществлялись с помощью следующих фосфолипид-зависимых тестов:

- АЧТВ с низким содержанием фосфолипидов (РТТ – LA; STAGO, France).

- время разведенного яда гадюки с разведенным тромбопластином (TTI, STAGO, France).

Если фосфолипидзависимые тесты были нормальными, то скрининговая проба на выявление ВА считалась отрицательной.

Удлинение фосфолипидзависимых тестов (одного или нескольких) диктовало необходимость проведения коррекционной пробы:

4. коррекционная проба осуществлялась путем смешивания исследуемой плазмы с нормальной плазмой в соотношении 1:1, 1:4 и 4:1 соответственно с целью исключению дефицита факторов.

Если при добавлении нормальной плазмы фосфолипид-зависимые тесты оставались удлиненными, проводились тесты, подтверждающие направленность циркулирующих ингибиторов против фосфолипидов.

3) подтверждающая проба – для этой цели использовались лизаты тромбоцитов (PNP, STAGO, France) и гексагональный фосфолипид (Staclot, STAGO, FRANCE).

Укорочение АЧТВ до нормы свидетельствовало об антифосфолипидной природе циркулирующих ингибиторов.

На IV этапе в ряде случаев проводилось дифференцирование других причин нарушения свертываемости крови – дефициты отдельных факторов и

другие специфические антикоагулянты.

Ниже приводится алгоритм процедуры определения ВА при использовании разных фосфолипидзависимых скринирующих тестов.

Мы считаем крайне важным правильную интерпретацию результатов исследования и исключение ложноположительных результатов.

7. удлинение АЧТВ и каолинового времени может быть при:

- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;

- дефиците факторов внутреннего пути свертывания;

- циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;

- дефиците витамина К как следствия мальабсорбции и длительной антибиотикотерапии;

механической желтухе;

- коагулопатии потроебления;

-гиперфибринолизе.

2) удлинение dRVVT может быть при:

- циркуляции ВА;

- циркуляции ингибитора фактора V;

- дефиците факторов V, X и I;

- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов.

3) удлинение протромбинового времени в тесте с разведенным тромбопластином может быть при:

- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;

- дефиците факторов внешнего пути свертывания;

циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;

- дефиците витамина К;

- механической желтухе;

- коагулопатии потребления.

Также проводилось определение концентрации АФА (IgA, IgG, IgM) иммуноферментным методом (Stago, Asserachrom APA). Средние титры – 20-40 GPIU/ml; высокие

- >40 GPIU/ml.

5. Оценка функционирования системы протеина С осуществлялась коагулометрическим методом с использованием коммерческих наборов «Парус-тест» фирмы «Технология-Стандарт», Барнаул, Росиия на приборе «START 4» (Stago, Франция).

6. Выявление генетически обуcловленных форм тромбофилии Молекулярный анализ генетических дефектов гемостаза выполнялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Основные этапы выявления генетических дефектов гемостаза включали: выделение ДНК; амплификацию (методом ПЦР);-рестрикцию.