Идентификация белка A-SAA в сыворотке крови

Для наилучшего определения пика, соответствующего A-SAA, был проведен подбор условий профилирования с использованием сывороток крови с известными концентрациями A-SAA (таблица № 7).

Было проведено профилирование всех сывороток крови на NP20 чипах с помощью протокола снятия спектров, сфокусированное на массах 11,52-11,68 кДа. Примеры масс-спектров, полученные с использованием

нормальнофазовых чипов NP20, приведены на рисунке 4.

Все пики в спектрах определяли автоматически с помощью программы Ciphergen Protein с базовыми настройками. При этом пик массой 11,68 кДа был определен во всех сыворотках с концентрацией A-SAA 0,333 г/л и более (по данным иммуноферментного анализа). Другими словами, все 19 сывороток с концентрацией A-SAA выше 0,3 г/л имели хорошо выраженный пик в интересующем нас интервале значений m/z (рисунок 5).

Среди исследованных образцов сывороток крови не было таковых с концентрацией A-SAA в пределах от 0,333 до 0,184 г/л. Это обстоятельство позволяет утверждать, что чувствительность масс-спектрометрического определения A-SAA в сыворотке крови лежит в пределах концентраций 0,20,3 г/л (1,7-2,6^10"⁵ М), что показано пунктирной линией на рисунке 2.

На рисунке 6 показана тенденция к увеличению интенсивности масс- спектрометрического сигнала, соответствующего сывороточному амилоиду А1а, с увеличением концентрации последнего, однако это увеличение не является монотонным. Коэффициент корреляции Спирмана между концентрацией A-SAA в сыворотке и интенсивностью масс-

спектрометрического сигнала составил 0,55, что соответствует умеренной корреляции.

иммуноферментный анализ позволяет измерить только его суммарное содержание.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что масс- спектрометрическая детекция A-SAA не является количественной, однако она позволяет определять A-SAA в сыворотке крови при его концентрациях 0,3 г/л и выше. Критический уровень 0,2-0,3 г/л соответствует 1,7-2,6^10"⁵ M.

Следует отметить, что критический уровень A-SAA, определяемый с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF, очень близок критическому уровню этого белка для ряда воспалительных заболеваний [Casl et al, 1995; Casl et al, 1996] и, поэтому, дает возможность использовать прямое масс- спектрометрическое профилирование для быстрого определения повышенного уровня A-SAA в сыворотке крови.

Масс-спектрометрическое определение масс методом SELDI-TOF-MS обладает невысокой точностью. Тем не менее, поскольку спектры были откалиброваны с использованием в качестве внешних стандартов белков, близких по массе к A-SAA, погрешность в определении массы A-SAA не превышала 3-5 Да, что позволяет различить различные формы A-SAA в сыворотках с содержанием A-SAA более 0,3 г/л.

Возможность наблюдать различные формы одних и тех же белков является важным преимуществом масс-спектрометрических методов по сравнению с иммунологическими методами детекции белков.

В 13 случаев, наряду с пиком 11683 Да, присутствует также пик равной или несколько меньшей интенсивности с m/z 11526 Да, соответствующий форме A-SAA с отщепленным аргинином на N-конце (рис. 7А).

В одном случае присутствует также небольшой пик с m/z 11439, который, по-видимому, соответствует SAA1a с отщепленными 2-мя N- концевыми аминокислотами аргинином и серином.

В 11 спектрах наблюдается пик более низкой, по сравнению с пиком SAA1a, интенсивности с m/z примерно 11628 Да, который, по-видимому, соответствует SAA2a.

В 8 из 11 спектров вместе с этим пиком наблюдается пик с m/z 11472, соответствующий форме SAA2a с отщепленным N-концевым аргинином (рис. 7А).

На трех масс-спектрах присутствует пик 11649 Да, соответствующий, предположительно, SAA2p.

На одном масс-спектре присутствуют одновременно пики 11645 Да (SAA2P), 11490 Да (SAA2P с отщепленным аргинином), 11404 Да (SAA2P с отщепленными аргинином и серином (рис. 7В).

Примеры различных форм сывороточного амилоида, детектированных на масс-спектрах, приведены на рисунке 7.

Как можно видеть на рисунке 7, в 16 из 18 спектров присутствует пик массой 11683 Да, соответствующий сывороточному амилоиду 1 альфа.

Контроль

Доброкачественная опухоль

яичника

Миома матки

Рак яичника

5000

10000

15000

20000

Рисунок 4. Примеры масс-спектров сывороток, полученных с использованием нормальнофазовых чипов NP20

Интенсивность

11000 11500 12000 12500 13000 13500

M/z, Да

Рисунок 5. Чувствительность определения A-SAA в сыворотке крови с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF. Для каждого спектра показаны значения концентрации A-SAA, измеренные методом иммуноферментного анализа. Стрелками показаны пики A-SAA на спектрах.

Концентрация A-SAA, г/л -—™-Интенсивность пика с m/z 11680 Да

Рисунок 6. Для каждой из 91 пробы приведены значения концентрации сывороточного амилоида А (г/л) и значения интенсивностей пика с m/z 1681, соответствующего основной форме сывороточного амилоида - SAAla.

Рисунок 7.

А: пики SAAla (11682,7 Да), SAAla с отщепленным N-концевым аргинином (11526,5 Да), SAA2a (11628,7 Да), SAA2a с отщепленным N-концевым аргинином (11472,5 Да);

Б: SAA1y (11654,7Да) и SAA1y с отщепленным N-концевым аргинином (11498,5 Да);

В: SAA2P (11647,8 Да), SAA2P с отщепленным N-концевым аргинином (11491,6 Да), SAA2P с отщепленными аргинином и серином (11404,5 Да).

Пик с m/z 11698 Да, предположительно, соответствует окисленной форме SAA1a.

На нескольких масс-спектрах присутствует также пик 11728-11740 Да, соответствующий, по-видимому, SAA1P, однако на большинстве спектров он плохо разрешен из-за высокой интенсивности соседнего пика SAA1a с m/z 11683 Да.

В одном случае мажорный пик группы сывороточного амилоида имеет m/z 11656 Да и соответствует, по-видимому, SAA1y. Вместе с ним на этом спектре присутствует пик 11495 Да, соответствующий форме SAA1y с отщепленным аргинином (рис. 7Б).

На одном спектре присутствует пик высокой интенсивности с m/z 11698, который отличается примерно на 16 Да от пика 11683 и может представлять собой окисленную форму последнего.

Полученные нами данные свидетельствуют, что основными аллелями А- SAA в исследуемой выборке являются SAA1a и SAA2a, что соответствует данным других авторов, проанализировавших иммуноаффинными методами с масс-спектрометрической детекцией 96 сывороток крови здоровых людей с целью определения различных модификаций преобладающих в ней белков, в том числе А-SAA. SAA1a и его фрагменты с отщепленными N-концевыми аминокислотами аргинином и серином были определены в 90 из 96 исследованных сывороток крови здоровых людей, а SAA2a и его фрагменты только в 35 из 96 образцов. В 18 образцах сыворотки крови определялся SAA1y и его модификации [Nedelkov et al, 2005].

В отличие от исследования Nedelkov и соавт., мы определяли А-SAA в цельной сыворотке и только в образцах с резко повышенным уровнем А-SAA, поэтому сведения, полученные нами, имеют оценочный характер.

Да) не превышает 0,2%, поэтому, при дальнейшей статистической обработке они идентифицировались как один пик.

Всего нами было определено 48 пиков в интервале m/z 5500-17500 Да, каждый из которых имеет высокую интенсивность (соотношение сигнал/шум > 5) по крайней мере в одной исследованной пробе. Мы пытались убедиться таким образом, что каждый из рассматриваемых пиков на масс-спектре соответствует реальному белковому продукту, а не является физическим артефактом или производным матрицы. Список интенсивностей полученных пиков для всех сывороток, разделенных на два класса («рак» и «отсутствие рака»), был использован в качестве исходных данных для разработки диагностических алгоритмов с использованием различных статистических методов.

3.4.