ГЛАВА 27. ФАГИ C ОТРОСТКАМИ

Большую группу высокоспециализированных вирусов про­кариотов (бактерий) и низших эукариотов (грибов) представ­ляют фаги с отростком (хвостатые фаги). В классификации вирусов [Matthews R., 1982] схематически представлены 3 группы этих вирусов, соответствующие 3 семействам: фаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом (Myoviridae), фаги с длинным несокращающимся отростком (Styloviridae) и фаги с коротким отростком (Podoviridae).

У изометрических фагов головка имеет форму икосаэдра. Диаметр головок колеблется в пределах 40—180 нм. У фагов с продолговатой головкой размер последней составляет 100? ?80 нм. Отросток (хвост) длинный (80—450 нм), состоит из шейки, трубки, сократительного чехла и фибрилл.

При взаимодействии с бактериями фаг прикрепляется к бактериальной клетке отростком с фибриллами, имеющийся на конце отростка лизозим разрушает клеточную стенку, че­хол сокращается, и отросток проникает в цитоплазму, куда затем поступает и ДНК фага. Репликация является весьма сложным и строго регулируемым процессом, столь же сложна сборка вирионов, которые покидают бактериальную клетку после ее лизиса. Наряду с репликативным (литическим) вза­имодействием (вирулентные фаги) может происходить интег­ративный процесс (образование профага умеренного вируса).

У стиловирусов (группа фага λ) геном имеет размер около 33?10⁶, ДНК с липкими концами, вирионы содержат около

260 -

Рис. 45. Организация генома фага T7.

1 — процент 77-геномов; 2 — транскрипция; 3 — TlДНК. и число генов; 4 — функцио­нальные группы генов.

10 структурных белков. Выделяют также две группы фагов—■ с изометрической и удлиненной головкой. Отросток не снаб­жен сокращающимся чехлом. Это также многочисленная груп­па. Вирусы могут вызвать литическую либо интегративную инфекцию (соответственно вирулентные и умеренные фаги).

У подовирусов геном имеет молекулярную массу около 25?10⁶. Вирионы содержат до 12 белков. Диаметр головки вирионов 65 нм, длина короткого отростка 17нм, имеются фиб­риллы. В этой группе также есть группы с изометрической и продолговатой головкой. Для этих групп вирусов характерно наличие ковалентно прикрепленного фосфодиэфирной связью к б'-концам ДНК терминального белка. У фага 029 Вас. sub- tiltsтаким белком является р28. Подобные терминальные белки обнаружены у фагов Ср-1, PRDlи др.

Рассматриваемым группам фагов посвящена чрезвычайно обширная литература, поэтому нет необходимости кратко из­лагать основные данные о морфологии и архитектуре вирио­нов бактериофагов, их химическом составе, структурных и функциональных белках, цикле репродукции, особенностях взаимоотношений с «хозяйскими» клетками. Поэтому ограни­чимся некоторыми иллюстрациями, позволяющими составить общее представление об этих фагах.

Фаг Р22 имеет короткий отросток [Suskind M., Bottstein D., 1978], близкородственны фаги ТЗ и T7 [Krueger D., Schroe­der C., 1981]. Молекулярная масса ДНК этих фагов 25?10⁶— 30?10⁶; на ДНК идентифицирован ряд генов (рис. 45). По­рядок их «действия» сходен у фагов групп Podoviridaeи у

Рис.

L — легкая и H — тяжелая ни­ти; 1 — первичная инициация;

2 — «окообразная» промежуточ­ная форма; 3 — репликационная вилка; 4 — конкатемеры.

лямбд Styloviridae. Эти данные свидетель­ствуют о сложности строения генома рас­сматриваемой группы и строгой регуляции экспрессии генов, ко­дирующих синтез

структурных и функ­циональных белков.

Репликация фаговой ДНК показана услов­но на рис. 46. Весь цикл репликации обес­печивается вирусной системой синтеза ДНК

(расплетающий белок, примаза, полимераза, лигаза) и в об­щих чертах повторяет синтез «хозяйской» ДНК.

Процесс формирования (морфогенеза) вирионов детально изучен на модели фага T4 (Myoviridae). Как видно из рис. 47 .[Wood W., 1978; 1980; Kellenberger E., 1980; Tsugita A. et al., 1980], в этом процессе участвуют 14 белков. Описываемые фаги относятся к высокоспециализированным вирусам.

Теперь попытаемся суммировать данные о проис­хождении и эволюции фагов рассматриваемой группы. К со­жалению, как и о вирусах большинства других групп, о про­исхождении фагов с отростком нельзя даже строить догадки, они появились как Deus ex machinae,без малейшего «намека» на возможные источники их происхождения. Конечно, фаги с отростком — это древние формы, эволюция которых длилась многие сотни миллионов лет, если не больше, так как, с одной

стороны, они поражают практически все основные группы бактерий, включая цианобактерии, а с другой стороны, в од­ной и той же группе бактерий можно встретить самые разно­образные формы хвостатых фагов (пример фагов Pseudomo­nasи Bacillus).Так, у Pseudomonasпри исследовании 62 фа­гов выделены 17 морфологических групп фагов с отростком,

Рис. 47. Пути сборки бак­териофага Т4. Пунктиром указаны этапы, которые не выявлены in vitro; цифры указывают номе­ра генов.

среди 99 фагов Ba­cillusвыделено 10 групп.

В ходе длитель­ной эволюции сло­жились очень спе­циализированные структуры, не имею­щие аналогов среди вирусов, появивших­ся позже и поража­ющих эукариотичес­кие организмы.

Гораздо больше информации можно получить о возмож­ных связях внутри рассматриваемых групп. Но прежде всего следует отметить, что эти группы явно не изолированы друг от друга и между ними имеются взаимосвязи. Так, ген 13 фага Р22 (подовирус) кодирует синтез белка с молекулярной массой 11 500, который имеет 89% гомологии с белком S фа­га λ (стиловирус). Ген 19фага Р22 кодирует синтез белка с молекулярной массой 16 000, проявляющего некоторую го­мологию с лизозимом фага Т4 (миовирус), хотя он не гомо­логичен белкам и Rи RZфага λ, выполняющим аналогичные функции [Rennel D., Potcete А., 1985]. Эти данные можно трактовать по-разному. Во-первых, еще недостаточно морфо­логических критериев для выделения таксономических групп, тем более таких, как семейство. В данном случае длина от­ростка, гибкость или ригидность его, наличие или отсутствие

сокращающегося чехла недостаточны, по-видимому, для вы­деления соответствующих групп вирусов в семействе. Во-вто­рых, поскольку одну и ту же клетку могут одновременно на­селять несколько фагов, возможны процессы рекомбинации — обмен генами у разных вирусов. Поэтому дивергентная дихо­томия вряд ли была единственным путем видообразования у фагов.

Эволюцию фагов следует рассматривать не только как эволюцию паразитов, патогенных для бактерий, но и как со­пряженную эволюцию двух партнеров, каждый из которых вносит свой вклад в процветание вида. Именно с этой точки зрения следует рассматривать феномен лизогении и лизоген­ные фаги [Herskowitz I., Hagen D., 1980]. Дополнительная генетическая информация, вносимая в геном «хозяйской» клетки, с одной стороны, обеспечивает иммунитет против род­ственного вирулентного фага, а с другой, может привнести и другие виды информации (устойчивость к антибиотикам, но­вые ферменты, токсины и др.), которые были «захвачены» фагом при «вырезывании» из лизогенной культуры бактерий.

Особый интерес представляют фаги, имеющие в своем ге­номе гены токсинов (дифтерийные фаги, фаги клостридий тетануса и ботулизма, фаги энтеробактерий и холерных виб­рионов, стафилококковые фаги). Наиболее подробно изучены фаги дифтерийных коринебактерий, продуцирующие дифте­рийный токсин. Сами по себе дифтерийные бактерии нетокси- генны и становятся таковыми при заражении их умеренными бактериофагами (В, cvи др.), несущими ген дифтерийного токсина. Будучи умеренными, эти бактериофаги интегрируют, с геномом коринебактерий, и экспрессия гена токсина обес­печивает продукцию токсина бактериальной клетки [Rap- puoli R. et al., 1983]. Нуклеотидная последовательность гена определена как у В[GreenfeId L. et al., 1983], так и cv [Rat- ti G. et а!., 1983] бактериофагов. В процессе биосинтеза про­исходят протеолитическое расщепление полипептидной цепи на субъединицы А(21 000) и В(40 000) и последующее со­единение субъединиц дисульфидными связями. Причем обе части токсина — адресная и токсофорная — приобретают окон­чательную конформацию. Адресный компонент (фрагмент В) взаимодействует с клеточными мембранами, и молекула ток­сина проникает через везикулы с кислым значением pH в ци­тозоль [Donovan et al., 1981], а токсофорный компонент (фрагмент А) инактивирует фактор элонгации 2,тем самым в клетке прекращается синтез белка, и клетка погибает [Zal­man L., WisnieskiB., 1984].

Сходные по структуре (две функционально разные субъ­единицы) экзотоксины широко распространены у бактерий, хотя «точкой приложения» токсофорного компонента могут быть разные клеточные системы. Наиболее сходны с дифте­рийным токсином нейротоксины клостридий ботулизма и те­тануса [Hoch D. et al., 1985]. Экзотоксины Pseudomonas aeru­ginosaи Shigella shigaeтакже имеют «точкой приложения» систему биосинтеза белка, холерогенный токсин и термола­бильный токсин кишечной палочки действуют на аденилат­циклазную систему, стафилококковый токсин обладает NAD- гликогидролазной активностью [Еремчук Ю.

Происхождение экзотоксинов и токсигенных фагов далеко не ясно. Во-первых, не все даже названные токсины привно­сятся в бактериальные клетки фагами, скорее наоборот: лишь для некоторых токсинов доказано привнесение в бактериаль­ные клетки бактериальными вирусами. Во-вторых, вполне вероятно, что экзотоксины первоначально возникли в бакте­риальных клетках, и лишь вторично их гены были захвачены фагами и включены в их геномы. Кроме того, токсины могут продуцироваться плазмидами (см. главу 6).

Значение токсигенных фагов можно проиллюстрировать на примере токсигенных дифтерийных фагов. Сама по себе дифтерийная коринебактерия нетоксигенна, не обладает ин- вирионными свойствами и персистирует на слизистых оболоч­ках. При заражении умеренным токсигенным дифтерийным фагом продуцируемый токсин вызывает некроз слизистых оболочек и резко улучшает условия для размножения кори- небактерий, компенсируя этим самым дополнительный гене­тический груз, обусловленный интеграцией вирусного генома в клеточный. Если эти соображения правильны, то при высо­ком антитоксическом иммунитете у населения на дифтерий­ную интоксикацию токсигенные коринебактерии будут посте­пенно вытесняться нетоксигенными, так как дополнительный генетический груз в виде профага не будет давать преиму­ществ токсигенным бактериям, поскольку ткани защищены от токсина антитоксическим иммунитетом.

В процессе эволюции интегрированные провирусы, содер­жащие гены для экзотоксинов., могли претерпеть мутации, сделавшие невозможным их вырезывание, и тогда мы относим токсичность к гену бактерии, если не сможем выявить дефект­

ный, но токсигенный профаг. Здесь же следует рассмотреть ингибицию репликации бактериофагов. лизогенами и экстра- хромосомными элементами [Dinkworth D. et al., 1981]. Этот феномен сначала был обнаружен при изучении фага λ кишеч­ной палочки. В лизогенном состоянии фаг угнетает размно­жение Т-четных фагов (T2, T4, Тб), точнее, их rllмутантов, не затрагивая прераннюю и раннюю стадии их синтеза, но приостанавливая образование поздних продуктов и сборку вирионов. Это действие связывают с геном гех фага λ. Этот ген также угнетает размножение фагов Tlи Т5. Сходным действием обладают и другие лизогенные фаги •— фаги Plи Р2 энтеробактерий, хотя механизмы такой ингибиции иные. Профаг Р22 сальмонелл также угнетает размножение как собственного, так и многих других суперинфицирующих фа­гов. В этом случае также идентифицирован соответствующий ген, ответственный за ингибицию.

В дальнейшем было показано, что угнетение репликации и абортивная инфекция вирулентных фагов могут быть вызва­ны экстрахромосомными факторами типа плазмид, в частно­сти фактором F.В этом случае имеют место сложные взаимо­отношения между фагами и «хозяйскими» клетками. Ингиби­рованию подвергается размножение фагов Т7, ФІ, ФП, W3I и Н, имеющих большие области гомологии ДНК- Некоторые из этих фагов адсорбируются преимущественно мужскими (W31),другие — женскими (ФП, Т7) клетками. В этих слу­чаях угнетаются поздние синтезы: при синтезе мРНК всех классов (I—III) транслируются только мРНКІ (трансляцион­ный контроль).

Описано также угнетающее действие факторов Rна раз­множение некоторых фагов (λ, P22, Т7). Ингибирующее дей­ствие колициногенов на фаги T5, BF23, T7, W 31,по-видимо­му, связано с общим угнетением синтезов «хозяйской» клетки.

Подводя итоги изложенному, можно выделить 3 главных механизма угнетения репликации фагов лизогенными фагами и экстрахромосомными элементами — резистентность клеток,, исключение суперинфекции и рестрикция.