ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основными возбудителями инвазивного кандидоза (ИК) являются C. albicans, C. parasilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, реже другие виды. В последнее десятилетие установлено, что по уровню заболеваемости (200000 пациентов ежегодно) в мире инвазивный кандидоз занимает второе место среди микозов и, несмотря на применение современных противогрибковых препаратов, характеризуется стабильно высокой летальностью 46 –75% [156].

В проведенном нами многоцентровом исследовании, посвященном изучению особенностей возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в период 2011–2014 гг. в России, впервые изучена этиология ВБИК с применением современных методов видовой идентификации грибов (MALDI-TOF масс-спектрометрии и ДНК-секвенирования). Изучены 322 клинических изолята Candida spp., выделенных от 258 пациентов из 37 стационаров в 12 городах России (6 Федеральных округов).

Исследование типов биоматериала (кровь и другие в норме стерильных биосубстраты), было обнаружено, что в 83,2% случаев изоляты Candida spp. были выделены из крови, в 7,5% – из перитонеальной жидкости. Зарубежные исследователи также отмечали, что изоляты Candida spp. из стерильных в

норме биосубстратов при ВБИК, чаще всего выделяются из крови [58].

Видовую идентификацию исследуемых штаммов Candida spp. ранее в мире проводили в основном с использованием морфологических и биохимических методов.

Так, в исследовании, проведенном более 10 лет назад в РФ [9] при видовой идентификации этиологии инвазивного кандидоза в ОРИТ г. Санкт- Петербурга (1998-2003 гг.) с использованием морфологических и биохимических методов (тест на ростковые трубки, тест-системы Fongiscreen, AUXACOLOR, API 20C AUX) было выделено 117 штаммов Candida spp., при этом неидентифицировано до вида было 8,5% изолятов. Однако, в последние годы молекулярно-биологические методы (ДНК- секвенирование, MALDI-TOF масс-спектрометрия) тоже начали внедрять в практику микробиологических лабораторий.

Определение видового спектра возбудителей ВБИК в нашем исследовании проведено методами ДНК-секвенирования, MALDI-TOF масс- спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR2. ДНК-секвенирование является рефентным методом видовой идентификации микроорганизмов; и MALDI-TOF масс-спектрометрия, по данным ряда исследователей, также является методом, приближенным по точности к референтному, но превосходит по быстроте идентификации. Однако, сравнительных исследований такого рода проведено относительно мало и на ограниченном количестве штаммов.

Результаты идентификации изолятов Candida spp. (97 штаммов) в нашем исследовании, полученные двумя методами (ДНК-секвенирование и MALDI-TOF масс-спектрометрия) совпали в 100% случаев. По данным

тайваньских ученых, при сравнительном исследовании результатов видовой идентификации 142 штаммов Candida spp. вышеуказанными методами, обнаружили совпадение в 98,6% случаев [134]. В сравнительном исследовании, проведенном в Кувейте, с использованием анализаторов Vitek МS, Bruker Biotyper МS и ДНК–секвенирования установлено, что методом MALDI-TOF масс-спектрометрии точно идентифицировано 86,7% изолятов.

При исследовании 322 штаммов Candida spp. с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системы AUXACOLOR2 нами обнаружено, что совпадение результатов идентификации составляет 93,2%. В аналогичном исследовании в Германии в 2010 г. совпадение между результатами MALDI- TOF масс-спектрометрии и AUXACOLOR2 составило 96,9% [86]. Наибольший процент несовпадений в нашем исследовании возникал из-за ошибочной идентифицикации некоторых изолятов Candida spp. тест- системой AUXACOLOR2. Так, 11 штаммов C. albicans были идентифицированы как C. dubliniensis. Кроме того метод AUXACOLOR2 не обеспечивал выявление редких видов (C. utilis, C. inconspicua, C. bracarensis, C. pararugosa). Таким образом, тест-системой AUXACOLOR2 определили, что 39,7% клинических изолятов принадлежли к C. albicans, и 59,7% – являются представителями других видов Candida, у 0,6% штаммов вид не определен. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии установлено, что

43.2% клинических изолятов принадлежали к C. albicans, и 56.8% были

представителями других видов Candida. Данным методом также была уточнена видовая принадлежность у штаммов неидентифицированных тест- системой AUXACOLOR 2 – C. utilis и C. lusitaniae. Состав C. не-albicans видов в нашем исследовании был представлен следующими патогенами:

20,2% – C. parapsilosis, 11,5% – C. glabrata, 9,6% – C. tropicalis, 6,2% – C. krusei, 5,3% – C. guilliermondii, 4% – остальные редкие виды (С.

54,6. Помимо этого, было отмечено сходство и среди C. не-albicans видов;

как и в России, лидирующую позицию в Испании занимала C. parapsilosis –

24,9%, далее следовали 13,4% - C. glabrata и 7,7% - C. tropicalis [65].

Из крови в нашем исследовании было выделено 14 видов Candida spp., где содержание C. albicans составляло 38,8%, C. не-albicans виды – 61,2%, в том числе и редкие виды. В других стерильных биосубстратах, в среднем, было обнаружено от 2 до 5 видов Candida spp., причем преобладал C. albicans (р 1 мкг/мл, также как и большинство зарубежных исследователей, В нашем исследовании МПК90 позаконазола составило 0,125 мкг/мл. В исследовании, проведенном в Бразилии, МПК90 позаконазола составляла 0,25 мкг/мл. [43].

При определении чувствительности Candida spp к противогрибковым препаратам диско-диффузионным методом - протокол CLSI M44-A (141 клинический изолят) мы выявили, что 67,4% штаммов были чувствительны к флуконазолу, 32,6% – обладали сниженной чувствительностью. Результаты, полученные в соответствии с двумя стандартными протоколами (CLSI M27- A3, критерии 2012 г. и CLSI M44-A) были сравнимы. Количество чувствительных штаммов C. albicans составило 96,3% и 3,7% - устойчивых к флуконазолу.

Для определения чувствительности к противогрибковым препаратам использовали также коммерческий метод Vitek2 Compact (82 изолята). Сопоставимость результатов, полученных с использованием протокола CLSI M27-A3 и метода Vitek2 Compact (по критериям интепретации CLSI M27-A3,

2012 г.) составляла от 78 до 100% в зависимости от вида изолята. Однако при сравнении результатов по критериям CLSI M27-A3, 2008 г. были отмечены несовпадения (12% в отношении флуконазола и 4,8% в отношении

вориконазола). В исследовании американских ученых в 2011 г., при сравнении результатов определения чувствительности к каспофунгину и позаконазолу методами CLSI M27-A3 и Vitek2 Compact, обнаружено, что совпадение для каспофунгина составило 99,5%, для позаконазола – 95,6%. Однако, в зависимости от вида Candida spp. вариации в совпадении по категориям чувствительности составляли от 30% (C. krusei) до 100% (C. guilliermondii, C. parapsilosis) для каспофунгина [108, 109]. Совпадение результатов чувствительности к флуконазолу и вориконазолу методами CLSI M27-A3, Vitek2 Compact, E-test в исследовании французских ученых (2010 г.) варьировало от 25% до 100% (25% – C. glabrata) [22].

В крупном проспективном исследовании FUNGINOS (Швейцария,

2004-2009 гг.), анализируя 1090 изолятов крови, сравнивали результаты их чувствительности по критериям интерпретации EUCAST и CLSI M27-A3 (2008 и 2012 гг.). Для C. albicans не было выявлено значимых отличий МИК флуконазола, вориконазола и каспофунгина, 98% штаммов были чувствительны.

Следовательно, на основании наших исследований можно заключить, что в качестве метода выбора определения чувствительности к противогрибковым препаратам возбудителей ВБИК в микробиологической практике можно рекомендовать диско-диффузионный метод (протокол M44- A) и микробиологический анализатор Vitek2 Compact с критериями CLSI M27-A3 (2012 г). Метод разведения в жидких питательных средах (протокол CLSI M27-A3), в связи с его трудоемкостью, можно рекомендовать к использованию в основном в референтных лабораториях.

Учитывая возрастающее значение комплекса видов C. parapsilosis при инвазивном кандидозе мы проанализировали 65 масс-спектро-профилей этого комплекса. Были выявлены только штаммы, принадлежащие к виду C.

parapsilosis sensu stricto, криптические виды C. metapsilosis, C. orthopsilosis не были обнаружены. Однако, в зарубежных исследованиях отмечают обнаружение и криптических видов комплекса C. parapsilosis – C. orthopsilosis, C. metapsilosis как методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, так и рефентным методом (ДНК-секвенирование). В Италии при сравнительном исследовании комплекса C. parapsilosis, в который входят такие виды как C. metapsilosis, C. orthopsilosis и собственно C. parapsilosis, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и AFLP (молекулярно- генетический метод) были выявлены все виды с высокой степенью точности, входящие в комплекс.

Путем проведения кластерного анализа нами выявлены сходные штаммы от разных пациентов – изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14,

15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург (в одном отделении и в один промежуток времени). Также выявлено, что в субкластере № 2 располагаются устойчивые к флуконазолу изоляты №№ 21 и 39, а в субкластере №3 находятся изоляты №№ 24 и 41, обладавшие устойчивостью также и к вориконазолу (изолят № 41).

Следует заметить, что поскольку среди исследуемых штаммов C. parapsilosis были выявлены сходные масс-спектры штаммов, к тому же имевшие устойчивость к азоловым препаратам в одном и том же субкластере, мы использовали ДНК – секвенирование в качестве метода поиска полиморфизма у данных устойчивых штаммов. Полиморфизм в регионе D1/D2 гена 28S рРНК, в том числе и множественный, был выявлен у чувствительных к флуконазолу и вориконазолу штаммах C. parapsilosis, у устойчивых штаммов полиморфизма не наблюдали. Следовательно, изучение в дальнейшем полиморфных вариантов генов Candida spp. будет перспективным при разработке быстрых методов определения устойчивости возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам.