Определение уровня внутриклеточных цитокинов в клетках крови. Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК)
МЛПК выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл- урографина по методу A.Boyum путем центрифугирования [Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow // Scand.
J. Clin. Lab. Invest. – 1968. – V. 267.– P. 95-99.]. Лейкомассу разводили средой 199 (ПанЭко, Россия), содержащей 25 ЕД/мл гепарина (Sigma), в 2 раза, затем наслаивали на градиент плотности фиколл- урографина (Pharmacia, США, плотностью 1,077 г/см3) с последующим центрифугированием при 400g 40 мин. МЛПК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждали центирифугированием при 250g. Доводили концентрацию клеток до 106 кл/мл RPMI-1640 (ПанЭко). Для стимуляции продукции цитокинов в культуру добавляли 10 мкг/ мл PHA (ПанЭко). Планшеты инкубировали 15-60 мин при 37°С, 5 % СО2, затем в лунки добавляли 10 мкг/мл Berefeldin A (e-Bioscience.com, США) и помещают в С02 инкубатор (37°С) на 15 часов. Из каждой лунки удаляли по 1 мл жидкости, осадок хорошо перемешивали.
Мембранное окрашивание. Определяли фенотип интересующих клеток (субпопуляции CD8+, СD16+ лимфоцитов). Для этого добавляли 3-5 мкл антител к поверхностным клеточным антигенам (согласно инструкции производителя). К клеткам добавляли по 150 мкл 4% формальдегида и инкубировали 20 мин при температуре 20 °С в темноте. Центрифугировали 300-450g 3-5 мин, удаляли надосадок. Пермеабилизация клеток и лизирование. Клетки ресуспендировали в 150 мкл Permeabilization WashBuffer (cat N 421001, BioLegend, США). Дважды откручивали при скорости 350 g в течение 7 мин. в пермеабилизирующем буфере.
Окрашивание цитокинов внутриклеточно. В лунки с клетками добавляли по 3-5 мкл антител к цитокинам и по 30-40 мкл пермеабилизирующего буфера. Инкубировали 20 мин при температуре 20 °С в темноте. Далее откручивали при 300-450 g 3-5 мин, добавляли 1% формальдегид. Данные анализировали на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter, США) после выделения логического гейта клеточной популяции в dot/plot распределении клеток по их
линейному переднему (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. При учете результатов анализировали минимум 10000 событий в гейте.
Еще по теме Определение уровня внутриклеточных цитокинов в клетках крови. Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК):
- Определение уровня свободных цитокинов в супернатантах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови.
- Определение уровня свободных цитокинов в сыворотках/плазме крови и супернатантах МЛПК
- Содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови
- Эмиграция лейкоцитов периферической крови в очаг воспаления
- Определение экспрессии Толл-подобных рецепторов (TLRs) на клетках крови, клетках кожи и клетках эпителия слизистой зева.
- Метод определения фагоцитарной реакции лейкоцитов крови
- Определение популяционного и субпопуляцнонного состава лимфоцитов периферической крови.
- Влияние КагОББО-инозина на содержание цитокинов, состояние рецепторов к эпидермальному фактору роста и активность митогенактивируемой протеинкиназной системы в периферической крови белых беспородных крыс с химиолучевым оральным мукозитом
- Особенности течения туберкулеза, сочетанного с ВИЧ- инфекцией при разном уровне содержания СІ)4-клеток в периферической крови
- Определение уровня аутоантител к коллагенам I, II, III, IV и V типов в плазме крови
- Определение уровня цитокинов
- 5.2. Результаты определения концентрации цисплатина в перфузате и периферической крови во время проведения химиогипертермической перфузии