Определение уровня свободных цитокинов в супернатантах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови.

Культуру МЛ инкубировали 24 часа в ростовой среде RPMI-1640 или RPMI- 1640 + ФГА (5 мкг/мл), затем исследовали спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов в супернатантах МЛ.

BenderMedSystems (Австрия). Уровень цитокинов определяли согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Culter, США). В лунки 24 луночного культурального планшета вносили по 2 мл разведенной (1:2) крови в среде RPMI-1640 (ПанЭко). Для стимуляции индукции цитокинов добавляли ФГА (10 мкг/мл, ПанЭко). Планшеты инкубировали 30 мин при 37°С, 5 % СО2. После инкубации в лунки добавляли по

4 мкл Brefeldin A (Biolegend, US) (до конечной концентрации 10 мкг/мл) и помещали в С02 инкубатор при 37 °С на 15 часов (на ночь). Из каждой лунки удаляли по 1 мл жидкости, осадок перемешивали и окрашивали PE или FITC- мечеными антителами к поверхностным клеточным антигенам. Мембранное окрашивание проводили с использованием МКА к CD8 согласно инструкции производителя (Biolegend, US). Вносили 3-5 мкл антител в лунку круглодонного иммунологического планшета, затем добавляли 50 мкл взвеси клеток и инкубировали 20 мин в темном месте при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл ФСБ или среды RPMI и отмывали при 350g 3-5 мин. Клетки фиксировали в 4% формальдегида, инкубировали 20 мин при комнатной температуре в темноте и

снова отмывали. Пермеабилизация клеток и лизирование. Фиксированные клетки ресуспендировали в 150 мкл Permeabilization WashBuffer (BioLegend). Отмывали клетки центрифугированием при 350 g 7 мин дважды в 150 мкл пермеабилизирующего буфера. Окрашивание внутриклеточных цитокинов. Далее в лунки с клетками добавляли по 3-5 мкл антител к цитокинам и по 40 мкл пермеабилизирующего буфера и инкубировали 20 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугировали дважды при 300-450 g 3-5 мин с добавлением 1% формальдегида для фиксации. Уровень цитокинов определяли на проточном цитометре FC-500 (Beckman Culter, США).