Определение уровня аутоантител к коллагенам I, II, III, IV и V типов в плазме крови

Уровень аутоантител к коллагенам I, II, III, IV и V типов в плазме крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем («Имтек», Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Метод основан на иммунологической реакции между аутоантителами к коллагену и коллагеном, иммобилизованным на внутренней поверхности лунок полистиролового планшета, с последующей детекцией образовавшегося комплекса с помощью пероксидазного конъюгата, ферментативная активность которого определяется по изменению окраски субстратной смеси. Количество связавшейся пероксидазы пропорционально количеству аутоантител в образце.

В лунки полистиролового планшета вносили образцы контрольной и исследуемой плазмы в разведении 1 : 50. В первый ряд планшета вносили в различных разведениях положительный контроль с исходной концентрацией 0,1 мг/мл. Планшет с растворами контрольных и исследуемых образцов инкубировали при комнатной температуре в течение часа с последующим трехкратным отмыванием не связавшихся белков. Затем во все лунки вносили разведенный конъюгат для проявления аутоантител (раствор очищенных кроличьих моноклональных антител к иммуноглобулину человека, конъюгированных с пероксидазой хрена) и инкубировали в тех же условиях. После трехкратного отмывания не связавшегося конъюгата для проявления реакции (окрашивания) вносили субстратную смесь (0,1% раствор ортофенилендиамина, содержащего 0,01% перекиси водорода) с последующей инкубацией при комнатной температуре до появления выраженного окрашивания в положительных контрольных образцах (2-10 минут). После этого реакцию останавливали 10% раствором серной кислоты. Интенсивность цветной реакции (оптическую плотность) измеряли на автоматическом фотометре вертикального сканирования («Мультискан», Венгрия) при длине волны 450 нм. Количественное определение аутоантител к коллагену производили с помощью калибровочной кривой, выстраиваемой при введении значений концентраций положительного контроля в различных разведениях и с учетом разведения исследуемых образцов.

Пример калибровочных кривых для определения уровня аутоантител к различным типам коллагена представлен на рисунке 3.5.

Таблица 3.1

Рис. 3.5. Образец калибровочных кривых для определения содержания аутоантител к коллагенам.

Концентрация аутоантител к коллагенам в плазме у 24 здоровых людей представлена на таблице 3.1.

Уровень аутоантител к коллагенам в плазме у здоровых людей

Постановка наборов для ИФА проводилась на базе научно- производственного отдела Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. Автор выражает благодарность д.т.н. И.В. Жарниковой за помощь в выполнении исследований специальной части.

3.2.