2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде – CLSI M27- A3
В данном исследовании применяется версия протокола (2008 г.) и критерии интерпретации результатов (2008 г. и 2012 г.).
Инокулюм готовили из 5 колоний 24-часовой культуры Candida spp.
на чашке Петри, суспендируя их в 5 мл 0,85% стерильного раствора NaCl до соответствия стандарту мутности 0,5 McFarland (1х106 – 5х106 клеток/мл). Рабочие суспензии далее разводили 1: 50 0,85% стерильным раствором NaCl, затем жидкой средой RPMI 1640 - 1: 20 (1х103 -5х103 ) клеток/мл.Для приготовления разведений субстанции противогрибковых препаратов промышленного приготовления (Sigma, Германия) флуконазол растворяли в стерильной воде, другие препараты (каспофунгин, позаконазол, вориконазол) – в диметилсульфоксид (ДМСО). Далее готовили основные растворы противогрибковых препаратов в концентрации 1280 мкг/мл. Затем, в соответствии со схемами, указанными в стандарте, разводили рабочие растворы противогрибковых препаратов: для вориконазола, позаконазола диапазон концентраций устанавливали от 0,0313 до 16 мкг /мл, для флуконазола - от 0,125 до 64 мкг /мл, для каспофунгина – от 0,015 до 8 мкг
/мл.
Выполнение микроразведений в жидких питательных средах проводили в стерильных одноразовых, 96-луночных планшетах с U- образными лунками. Двукратные концентрации препаратов вносили в ряды с
1 по 10 лунки планшета в объеме 100 мкл микроканальными пипетками. Первые лунки рядов содержали самые высокие (64 или 16 мкг/мл)
концентрации препарата, а десятые лунки - самые низкие концентрации препарата (0,12 или 0,03 мкг/мл). Далее в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл соответствующего двойного разведения суспензии инокулюма, таким образом, получая разведения препарата и плотность инокулюма в конечной концентрации. Лунки контроля роста содержали 100 мкл стерильной среды, без препарата с соответствующим разведением суспензии инокулюма. Последнюю лунку планшета использовали для контроля стерильности (среда без препарата).
В качестве контроля качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC 22019(РКПГY-1245). Планшеты инкубировали в термостате при температуре 350С
в течении 24 часов. Учет результатов производили визуально с использованием следующей цифровой шкалы: 0 - оптически прозрачно,1- легкая мутность, 2- заметное снижение (~ 50%) видимого роста, 3 – слабое подавление видимого роста, 4 – нет подавления видимого роста. Далее сравнивали с критериями интерпретации МПК флуконазола, вориконазола и каспофунгина (2008 г., 2012г) указаны в таблицах 6 и 7.
Таблица 6 – Критерии интерпретации CLSI M27-S3 (2008 г.)
| Препарат | Диапозон МПК (мкг/мл) | ||
| Чувствительные (Ч) | Умеренно- чувствительные (УЧ) | Усточивые (У) | |
| Флуконазол | 64 | ||
| Вориконазол | 4 | ||
| Каспофунгин | 2 | ||
Таблица 7 – Критерии интерпретации результатов определения
чувствительности (CLSI M27-S4, 2012 г.)