Иммуногистохимия и поточная цитофлуориметрия

Оценка локализации и степени экспрессии белковых антигенов на поверхности и внутри клеток проводилась с помощью непрямого сэндвич-метода с использованием моно- и поликлональных антител, иммуно-флуоресцентной и авидин-битиновой техники.Характеристики использованных антител и отдельных компонентов суммированы в Таблице 1.

параформальдегида на фосфатном буфере Дульбекко (ФБД) с добавлением 0.1 % Тритона Х-100. В ряде экспериментов для фиксации использовали охлажденный до - 20°С метанол. После серии отмывок ФБД или раствором Эрла клетки инкубировали в течение 30 минут в 1 % растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) для

снижения неспецифического связывания антител. Антитела к соответствующим антигенам разводили в ФБД- БСА; продолжительность инкубации составляла 30-60

Таблица 1. Характеристика антител и систем их выявления

•Источник: 1 - Sigma; 2 - Becton-Dickinson; 3 - Fisher; 4-6 - любезно предоставлены А.В.Мазуровым, Б.В.Шехониным и О.В.Митькевич, ИЭК РКНПК М3 РФ; 7 - получены от О.Н.Щегловитовой, НИИ ЭМ им.

минут при +37°С или 1-2 часа при комнатной температуре. Последующие манипуляции проводились при комнатной температуре. Клетки отмывали ФБД-БСА и последовательно инкубировали с биотинилированными антителами и комплексом страптавидин-пероксидаза. Пероксидазную активность выявляли с помощью субстратов на основе диаминобензидина или входящих в состав коммерческих наборов (HistoScan, Biomeda). В заключение, препараты докрашивали гематоксилином и заключали в глицерин-желатину.

В некоторых случаях (например, при выявлении Е-селектина) методику модифицировали следующим образом: клетки помещали на лсд и инкубировали с антителами без предварительной фиксации. В этом случае, антитела разводили на среде 199 с 1 % БСА или на полной среде культивирования. После инкубации при +4°С клетки отмывали от несвязавшихся антител и фиксировали 1 % раствором параформальдегида на ФБД. Дальнейшую обработку проводили по методике, приведенной выше.

Количественную оценку изменения экспрессии клетками различных антигенов проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Для этого,

исследуемые культуры отмывали от среды культивирования раствором Эрла, аккуратно снимали раствором трипсина-ЭДТА и сразу переносили в охлажденную до +4°С среду 199 с добавлением 1 % БСА и 1 мг/мл ингибитора трипсина. После центрифугирования клетки ресуспендировали в свежей среде 199 и, при постоянном перемешивании, добавляли 4 % раствор параформальдегида на ФБД до конечной концентрации 1 %. После 10 минутной фиксации и отмывки центрифугированием клетки инкубировали в течение 1 часа с антителами к соответствующему антигену, приготовленными на ФБД-БСА. После отмывки центрифугирование.м в ФБД-БСА клетки инкубировали с ФИТЦ- или РИТЦ-меченными антителами "2-го этажа” в течение 30 минут и, после однократного центрифугирования в ФБД, использовали для анализа.

В случае антител к Е-селектииу поступали следующим образом. После снятия трипсином-ЭДТА и отмывки клетки переносили на лед и инкубировали с антителами живыми, т.е.

Анализ окрашенных клеточных суспензий проводили на проточном цитофлуориметре FACScan или FACS Calibur (Becton Dickinson).

Локализацию фибриллярного актина (F-актина) определяли с помощью флуоресцентной техники: культуры фиксировали в растворе параформальдегида, как описано выше, и инкубировали 10 минут в растворе РИТЦ-фаллоидина (Sigma) на ФБД. Препараты заключали в Мовиол (Fluka) или глицерин-ФБД (1:1), просматривали и фотографировали на микроскопе Photomicroscope III (Opton).

8. Статистический анализ

Достоверность различий между экспериментальными группами определяли с использованием t-тестов для парных и непарных случаев с применением компьютерной программы Statistica 2.0. Отклонения от среднего значения, приведенные в тексте работы, соответствуют SD (среднеквадратичное отклонение).