Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции

Подготовка клеток и тканей

Выявление антигенов в клетках и тканях с помощью иммуногистохимии осуществляется в несколько этапов. Исследуемые образцы замораживаются или заключаются в парафин, режутся на микротоме и помещаются на предметные стекла.

Для ИГХ пригоден практически любой материал: цитологические мазки, свежезамороженная или фиксированная ткань. Выбор исследуемого материала должен определяться свойствами изучаемого антигена: так, большинство цито­плазматических антигенов выявляются на фиксированных формальдегидом и залитых в парафин срезах; поверхностные клеточные антигены, как правило, разрушаются или маскируются при обычной фиксации и могут быть выявлены только на свежезамороженных тканях либо в культуре клеток.

Фиксация

Основная часть гистологических и цитологических методик направлена на сохранение морфологической структуры клеток и тканей, для этого иссле­дуемые образцы помещают в фиксирующие растворы. Фиксация необходима для предотвращения аутолиза антигенов; при этом блокируются лизосомные

ферменты и предотвращается рост бактерий, которые вызывают разрушение клеточной структуры.

Положительный результат иммуногистохимической реакции во многом определяется адекватной фиксацией исследуемых антигенов в тканях. Выяв­ляемый антиген должен быть нерастворимым в жидкостях за счет процесса фиксации его к тканевым компонентам.

Фиксация мазков крови и цитологических препаратов. Перед фиксацией

препараты высушивают 1-2 часа при комнатной температуре для предотвраще­ния повреждения клеток. При высушивании клетки плотно прилипают к стеклу и не смываются при последующей фиксации. Высушивание не повреждает струк­туры поверхностных антигенов лейкоцитов. Мазки фиксируют либо в абсолют­ном ацетоне, либо в 96° этаноле 1-3 мин, с последующей окраской клеток.

Приготовление срезов тканей

Иммуногистохимия на криостатных срезах. Криостатные срезы подхо­дят для выявления большинства антигенов. Срезы толщиной 5 мкм помещают на покрытые поли^-лизином стекла и высушивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Срезы фиксируют, погружая в холодный ацетон -20°С,

либо другой фиксатор (этиловый спирт, формалин и т. п.) на 2 мин. Стекла вы­сушивают на воздухе и проводят регидратацию в 1% неиммунной бычьей сы­воротке в солевом фосфатном буфере (PBS), затем осуществляют иммуноги­стохимическую реакцию.

Иммуногистохимия на парафиновых срезах. Современные методы дема­скирования клеточных антигенов позволяют проводить ИГХ реакции на пара­финовых срезах. При этом в качестве фиксатора может быть использован 10% раствор забуференного формальдегида.

Заливка в парафин:

1. Фиксация в забуференном формалине - сутки.

2. Промывка в проточной воде - 2 часа.

3. 70% этанол - 30 мин.

4. 80% этанол - 30 мин.

5. 90% этанол - 30 мин.

6. 100% этанол - 3 смены по 1 часу.

7. Ксилол/ этанол 1:1 - 15 мин.

8. Ксилол - 2 смены по 30 мин.

9. Ксилол/ парафин 1:1 при 56°С - 30 мин.

10. Парафин - 2 смены при 56°С 1 час.

11. Заливка.

Перед проведением ИГХ реакции на парафиновых срезах необходимо осуществить их регидратацию. Срезы толщиной 4-5 мкм режутся на покрытые поли-к-лизином стекла, затем высушиваются при 37°С в течение ночи и 1 час при 60°С.

Регидратация:

1. Ксилол - 3 смены по 5 мин.

2. 100% этанол - 2 смены по 3 мин.

3. 96% этанол - 2 смены по 3 мин.

4. 80% этанол - 3 мин.

5. Дистиллированная вода - 2 смены по 3 мин.

Демаскирование антигенов

После фиксации в формалине и заливки в парафин тканевые антигены необходимо демаскировать. Эта процедура направлена на восстановление ори­гинальной структуры белка. Методы демаскирования антигенов, такие как об­работка протеолитическими ферментами или нагревание в микроволновой печи после формалиновой фиксации и заключения в парафин способствуют обнару­жению не выявляемых ранее антигенов.

Демаскирование клеточных антигенов ферментами (трипсин, протеиназа К, проназа) применяется, как правило, для цитокератинов и некоторых других клеточных антигенов. Другой способ «освобождения» антигенов осуществляет­ся путем нагревания, при этом отмечается усиление иммуногистохимической реакции на срезах, фиксированных в формалине. Для нагревания можно ис­пользовать как водяную баню, так и микроволновую печь. Как правило, нагре­вание срезов проводят в 10мМ цитратном буфере при рН 6,0.

Протокол обработки срезов ферментами:

1. Поместить срезы в дистиллированную воду.

2. Приготовить 0,1% раствор трипсина или протеиназы К в PBS (рН 7,6).

3. Инкубировать при 37°С от 15 до 60 мин.

4. Остановить действие фермента ополаскиванием в холодной воде.

5. Перенести в PBS.

Протокол обработки срезов в микроволновой печи:

1. Поместить срезы в пластиковый контейнер с 10 мМ цитратным буфе­ром (pH 6,0).

2. Нагревать срезы при мощности 700 Вт 7 мин.

3. Долить испарившуюся жидкость и нагревать срезы при мощности 350 Вт 20 мин.

4. Остудить срезы вне печи в течение 15 мин.

5. Перенести срезы в PBS.

Блокировка эндогенной активности ферментов

Эндогенная активность пероксидазы. Пероксидазная активность встре­чается во многих клетках организма: эритроцитах (гемоглобин), миоцитах (ми- оглобин), макрофагах и нейтрофилах (цитохромы), гепатоцитах и эпителии по­чек (каталаза). Для нейтрализации эндогенной пероксидазной активности на срезы на 10 мин наносят 1-3% раствор перекиси водорода.

Эндогенная активность щелочной фосфатазы. Блокирование щелочной фосфатазы осуществляют 5 мМ раствором левамизоля.

Биотин. Витамин Н - биотин - присутствует в печени, почках и др. орга­нах. При использовании по время ИГХ реакции пероксидазно-авидинового комплекса для визуализации меченых биотином вторичных антител, возможно его неспецифическое связывание с клеточными компонентами, содержащими эндогенный биотин. Для предотвращения подобной неспецифической реакции перед осуществлением блокирования эндогенной пероксидазы проводят инку­бацию срезов в 0,1% р-ре авидина, а затем в 0,01% растворе биотина в Трис­буфере (ТБС). Второй способ избежать неспецифической реакции с биотином - это использование современных безбиотиновых систем визуализации антиге­нов.

Проведение иммуногистохимической реакции

Существует множество различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена: прямой метод, не­прямые методы, методы с использованием ферментных иммунных комплексов, авидин-биотиновые методы и др.

Прямой метод. Эта методика была разработана A.H. Coons, M.H. Kaplan (1950). Меченые ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом) первичные антитела на­носили непосредственно на срезы. После инкубации несвязанные антитела смывали фосфатным буфером и с помощью ультрафиолетового света выявляли места локализации антигенов по зеленоватой флюоресценции.

Непрямой метод. Был также описан A.H. Coons с соавт. (1955). Этот ме­тод более чувствителен, чем прямой, т.е. то же количество первичных антител, присоединенных к тканевым антигенам, будет более интенсивно окрашиваться по сравнению с прямым методом либо то же количество антигенов можно ло­кализовать за счет более низкой концентрации первичных антител. Первичные немеченые антитела наносят на срезы, а их избыток смывается буфером. Затем наносятся вторичные конъюгированные с ФИТЦ антитела, принадлежащие другому виду животных, полученные к гамма-глобулиновой фракции сыворот­ки крови животных, использовавшихся в качестве первичных антител. В этом случае первичные антитела, связавшиеся с антигенами исследуемой ткани яв­ляются антигенами для меченых вторичных антител, которые также распреде­ляются в месте локализации тканевых антигенов.

Другим преимуществом непрямого метода является возможность приме­нения одних и тех же меченых вторичных антител, при использовании первич­ных антител от одного и того же вида животных. Маркеры для этого метода могут быть флуоресцентными (флуоресцин, родамин), ферментными (перокси- даза хрена), а также коллоидное золото.

Не конъюгированный антигенно-ферментный метод. Название связано с тем, что как первичные, так и вторичные антитела не конъюгируются с марке­рами. В свою очередь, вторичные антитела используются как мостик между первичными антителами и конечными, которые также не конъюгируются, а по­лучаются путем иммунизации животных того же вида, что и первичные антите­ла к пероксидазе хрена. За последним слоем антител наносится пероксидаза хрена, которая присоединяется путем реакции антиген-антитело и затем прояв­

ляется гистохимически. За счет отсутствия химической конъюгации, не повре­ждается иммунологическая реактивность всех антител.

Одиночный мост. Первым слоем может быть кроличья сыворотка, полу­ченная против первичного антигена, второй слой - неконъюгированная сыво­ротка козы против кроличьих гаммаглобулинов и третий слой - кроличья сыво­ротка, полученная против пероксидазы хрена, которая затем проявляется гисто­химическим методом, таким как диаминобензидин и перекись водорода по R.C.

Двойной мост. Он включает повторение второго слоя, сыворотки козы против кроличьих иммуноглобулинов после кроличьей антипероксидазной сы­воротки и затем повторение кроличьей антипероксидазной сыворотки перед нанесением пероксидазы и её визуализацией, таким образом достигается уве­личение числа мест, связывающих пероксидазу.

Пероксидазно-антипероксидазный метод. Развитие этого метода L.A. Sternberger (1979) оказало большое влияние на иммуногистохимию. Модифи­кация Штейнбергом мостовой методики заключалась в проведении реакции ан- типероксидазных антител с пероксидазой перед нанесением их на ткани. Эта реакция приводила к образованию стабильного комплекса трех молекул перок- сидазы хрена с двумя молекулами антител. Этот комплекс отделялся от непро­реагировавших антител и пероксидазы перед использованием. Он реагирует как антиген третьего слоя. Первый слой составляют кроличьи антитела, реагирую­щие с тканевыми антигенами, второй слой образует неконъюгированная вто­ричная сыворотка козы против кроличьих антител в избытке, таким образом одно из парных соединительных мест антител (Fab-часть) является свободной для реагирования с третьим слоем кроличьего ПАП комплекса. Таким образом, обеспечивается высокое соотношение между количеством пероксидазного мар­кера и первичным антигеном. Кроличьи ПАП молекулы реагируют только с ан­тикроличьими иммуноглобулинами козы второго слоя, и это обеспечивает от­сутствие неспецифического связывания с тканью. Это специфичная и свобод­

ная от фона реакция. Для увеличения интенсивности, нанесение второго и третьего слоев можно повторить.

Авидин-биотиновый метод. Два новых вещества стали использовались в иммуногистохимии после исследований J.L. Guesdon с соавт. (1979) - биотин и авидин. Биотин (витамин Н) в большом количестве содержится в белках птичь­их яиц, где он связан с большим гликопротеидом - авидином. Авидин имеет высокую аффинность к биотину, одна его молекула может присоединить 4 мо­лекулы биотина. Биотин может связываться с Fc-иммуноглобулинами, каждая молекула биотина имеет одно место связывания, но с одной молекулой имму­ноглобулина могут связываться несколько молекул биотина. Как биотин, так и авидин могут быть помечены флуоресцентной меткой, ферментом, ферритином или молекулой золота. Методика с использованием авидин-биотиновых ком­плексов считается соответствующей либо даже превышающей ПАП метод по чувствительности. В этой методике первый слой представляют первичные кро­личьи антитела; второй слой составляют биотинилированные антикроличьи иммуноглобулины козы; третий слой представлен авидин-биотиновым ком­плексом. Авидин реагирует с биотинилированной пероксидазой хрена в такой пропорции, при которой три связывающих места авидина взаимодействуют с биотинилированной пероксидазой, оставшееся одно место на каждой молекуле является свободным для взаимодействия с биотином второго слоя антител. Ме­тод блокирования неспецифического взаимодействия с тканевым биотином был предложен G.S. Wood и R. Warnke (1981). Неконъюгированный авидин на­носится на ткани для связывания биотина и затем добавляется в избытке не­конъюгированный биотин для предупреждения любого связывания авидин- биотинового комплекса.

В последнее время различными фирмами разработаны новые методы ви­зуализации иммуногистохимической реакции с использованием конъюгатов по­лимеров. К длинной молекуле полимера присоединяется большое количество фермента. За счет увеличения концентрации фермента повышается чувстви­тельность метода. При этом с полимером могут быть конъюгированы как пер­

вичные антитела, так и молекулы фермента EPOS (Enhanced Polymer One Step­staining) фирмы Dako. Если с молекулой полимера конъюгируются вторичные антитела и фермент (EnVision, фирмы Dako), то иммуногистохимическая реак­ция проводится в два этапа, при этом достигается высокая чувствительность по сравнению с другими методами визуализации.

Наибольшую популярность в настоящее время получили иммуногисто­химические методики, использующие для визуализации реакции ферменты пе- роксидазу хрена или щелочную фосфатазу, с использованием стрептовидин- биотинового комплекса. Эта методика проводится в три этапа: нанесение неок­рашенных первичных антител, затем биотинилированных вторичных антител и добавление связанного с молекулами фермента стрептовидина (Dabbs D.J., 2002). Необходимо отметить, что чувствительность ИГХ методики во многом зависит от используемых реагентов и особенностей проведения реакции, в свя­зи с чем, сложно сравнивать результаты ИГХ при использовании различных ре­активов и методических приемов.

Важными условиями проведения иммуногистохимической реакции явля­ется подбор титра антител. Титром антител называют максимальное разведение сыворотки, при котором наблюдается выраженное специфическое окрашивание без неспецифического фонового окрашивания окружающих тканей. Все ком­мерческие антитела имеют инструкции с описанием оптимального разведения, однако часто подбирать титр антител приходится экспериментально, поскольку этот показатель зависит от таких причин, как длительность инкубации первич­ной сыворотки, окружающая температура, выбранная система визуализации распределения первичных антител и т. п.

Перед нанесением первичных антител срезы помещают на 1-2 мин в PBS, затем необходимо удалить избыток буфера вокруг среза и капнуть на срез не­большое количество первичной сыворотки от 30 до 50 мкл в зависимости от площади среза. Затем срезы помещают горизонтально во влажную герметич­ную камеру на подставку, под которой находится фильтровальная бумага, смо­ченная водой, для предотвращения неспецифического связывания антител с

тканью за счет их высыхания. И проводят инкубацию при комнатной темпера­туре в течение 15-30 мин в зависимости от рекомендаций производителя анти­тел. Для ускорения процессов связывания антител с антигенами можно прово­дить инкубацию при температуре 37°С. Для повышения интенсивности ИГХ реакции и увеличения разведения используемой сыворотки можно проводить реакцию при 4°С в холодильнике в течение ночи.

Протокол иммуногистохимической реакции, предлагаемый компанией

Dako.

1. Приготовить парафиновые срезы на стеклах, покрытых поли-L- лизином, провести депарафинирование и регидратацию в TBS (Dako TBS, S196830, добавить 0,05% Tween 20).

2. Удалить избыток жидкости вокруг срезов и капнуть 1% р-р перекиси водорода 10 мин.

3. Промыть в TBS.

4. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.

5. Нанести первичные антитела (мышиные или кроличьи). Инкубировать 30 мин при комнатной температуре во влажной камере.

6. Промыть в TBS.

7. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.

8. Нанести вторичные антитела (смесь антимышиных или антикроличь­их биотинилированных антител). Инкубировать 15-30 мин при комнатной тем­пературе во влажной камере.

9. Промыть в TBS.

10. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.

11. Нанести конъюгированный с пероксидазой стрептавидин. Инкубиро­вать 15-30 мин при комнатной температуре во влажной камере.

12. Промыть в TBS.

13. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.

14. Провести гистохимическое выявление пероксидазной активности с раствором диаминобензидина 5-10 мин.

15. Промыть в воде.

16. Докрасить ядра гематоксилином Майера 1-2 мин.

17. Промыть срезы в проточной воде.

18. Провести дегидратацию в восходящей батареи спиртов.

19. Заключить срезы в канадский бальзам.