Тема № 1. Введение. История развития метода.

Основные фундаментальные знания в области иммунохимии

Введение

Иммуногистохимия (ИГХ) - метод выявления точной локализации кле­точного или тканевого компонента (антигена) с помощью иммунологических и гистохимических реакций; при этом иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала проводится в условиях сохранения морфологии клеток.

В диагностической практике можно выделить несколько основных облас­тей применения ИГХ: во-первых, при исследовании опухолей человека с целью определения гистогенеза недифференцированных опухолевых образований, от­даленных метастазов, для дифференцировки различных тканевых компонентов, составляющих комплексные опухоли; во-вторых, с целью прогностической оценки дальнейшего течения заболевания и, наконец, при назначении терапии.

Особую ценность иммуногистохимия приобретает в том случае, когда имеются трудности в определении гистогенетической принадлежности опухо­левой ткани на основании изучения рутинных срезов, окрашенных гематокси- лин-зозином, при этом морфологи нередко используют термин «недифферен­цированные опухоли». Выявление гистогенеза опухоли необходимо для реше­ния вопроса о тактике лечения заболевания и прогностической оценке. Наи­большее клиническое применение в настоящее время ИГХ получила при клас­сификации лейкозов и лимфом. Определенные панели антител позволяют оха­рактеризовать острые и хронические лейкозы, лимфогранулематоз и различные типы неходжкинских лимфом. Так, используя антитела к общему лейкоцитар­

ному антигену, выявляют лимфомы, а антитела к белкам S-100 и HMB-45 по­зволяют определить меланомы.

Иммуногистохимические исследования с целью оценить органоспеци­фичность отдаленных метастазов проводятся с использованием набора антител, характеризующих антигенные свойства клеток различных органов: в частно­сти, антитела к PSA выявляют рак простаты; наличие в опухолевой ткани ре­цепторов к эстрогенам и прогестерону позволяет сделать предположение о ме­тастазе из молочной железы или эндометрия; антитела к тиреоглобулину выяв­ляют опухолевые клетки фолликулярного рака щитовидной железы.

С целью прогностической оценки заболевания, предсказания биологиче­ского поведения опухоли, появления метастазов, эффективности терапии про­водят исследование пролиферативной активности (Ki-67), выраженности ангио­генеза, определение рецепторов факторов роста (продукты онкогенов her-2/neu при раке молочной железы), выявление рецепторов к стероидным гормонам, изучение степени анаплазии клеток (мутантный белок гена p53).

Несомненна роль ИГХ исследования при определении рецепторов к эст­рогенам и прогестерону для назначения ряда гормональных препаратов (тамок- сифен).

Таким образом, ИГХ представляет ценный современный метод диагно­стики, позволяющий определить гистогенез, степень пролиферативной актив­ности и анаплазии опухолевых клеток, охарактеризовать прогноз и предложить адекватные методы лечения пациентов. Однако не следует и преувеличивать возможности данного метода при лечении конкретного пациента. ИГХ является только дополнительной методикой исследования, и ее результаты должны быть

интерпретированы в контексте с другими данными обследования, включая клинические.

История развития метода

Основной принцип иммуногистохимии был предложен 70 лет назад J.R. Marrack (1934) и заключается в том, что в качестве гистохимических реагентов используют антитела, к которым присоединяют определенный флуоресцентный маркер. Авторами метода по праву считается группа исследователей под руко­водством A.H. Coons, которая в 1942 году впервые с помощью антител, мечен­ных изоцианатом, выявила антигены пневмококков в инфицированных тканях (Coons A.H. et al., 1941; 1955). Затем ИГХ применяли в области эндокринологии для выявления мест синтеза различных гормонов. Однако эта методика не на­ходила широкого применения из-за сложностей, связанных с использованием флуоресцентных микроскопов, трудностей выявления основных компонентов тканей и высокой чувствительности флуоресцентных маркеров к дегидратации.

Одним из важных открытий для дальнейшего широкого использования иммуногистохимии было выявление в 1951 году J.M. Marshall возможности ло­кализовать in vitro молекулы адренокортикотропного гормона в гипофизе с по­мощью антител, меченных флуоресцентными маркерами. Локализация эндо­генных антигенов in vivo была осуществлена через 4 года с помощью непрямо­го метода. В этих экспериментах кроличья антисыворотка против крысиного почечного антигена была введена крысам и на замороженных срезах почки крысы было выявлено наличие гамма-глобулинов с помощью меченных флуо­ресцентным маркером цыплячьих антител против кроличьих глобулинов.

В 1960 году для осуществления визуализации антител в электронной микроскопии было введено большое количество маркеров тяжелых металлов, таких как ферритин, коллоидное золото. Тяжелые металлы не являются идеаль­ными маркерами для иммуногистохимии по самым различным техническим причинам, хотя сейчас применяются оригинальные методики с использованием коллоидного золота.

Методы использования конъюгированных ферментами антител были не­зависимо разработаны P.K. Nakane, G.B. Pierce (1966) и S. Avrameas, J. Uriel (1966). Наибольшую популярность получил пероксидазно-антипероксидазный

метод L.A. Sternberger с соавт. (1977). Для визуализации энзиматических мар­керов в конце реакции антиген-антитело проводят гистохимическую реакцию, в результате которой фермент становится видимым на световом уровне. Даль­нейшее усовершенствование этой реакции привело к тому, что продукты реак­ции были видны и на электронно-микроскопическом уровне, за счет взаимо­действия с осмием они становились электронно-плотными.

В последние годы применение иммуногистохимии в морфологии широко развивалось в связи с разработкой новых методов конъюгации антител, фикса­ции тканей, демаскирования антигенов, а также использования новых ламп и фильтров для флуоресцентной микроскопии.

Основные фундаментальные знания в области иммунохимии

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие анти­гена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген­антитело».

Антигены - чужеродные вещества сложной органической природы, спо­собные при попадании в организм вызывать иммунные реакции. Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом. Различают полные и неполные антигены. Полные антигены - это белки, поли­сахариды, нуклеиновые кислоты, синтетические высокополимерные соедине­ния, вирусы, паразиты, бактерии. Неполные антигены, или гаптены, - низкомо­лекулярные соединения, которые сами по себе не могут вызывать иммунного ответа, однако, соединяясь с клетками и тканями организма, в комплексе стано­вятся полными антигенами, способными вызывать иммунный ответ.

Антитела - вещества белковой природы, которые образуются в организме в ответ на антигены и, специфически взаимодействуя с ними, уничтожают их, обеспечивая гуморальный иммунитет. Антитела обладают специфичностью к антигенам, т.е. связываются только с тем антигеном, на который вырабатыва­лись.

Антитела принадлежат к группе белков иммуноглобулинов - близкие по химическому строению и свойствам глобулярные белки, которые обладают способностью соединяться с антигенами. Антигены, попадая в организм, спо­собствуют образованию антител. У человека и высших позвоночных известно 5 классов иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Молекулы иммуногло­булинов (Ig) построены из легких и тяжелых полипептидных цепей, располо­женных симметрично (L- и H-цепи). Легкие и тяжелые цепи состоят из двух областей - вариабельной и постоянной. Вариабельные участки принимают уча­стие в контакте с антигеном, это определяет специфичность антител. Антитела чувствительны к протеолитическим ферментам и распадаются на два идентич­ных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагменты сохраняют свою спо­собность связываться с антигеном. Fc-фрагмент не способен связываться с ан­тигеном, он определяет специфичность связывания молекулы Ig с клетками- эффекторами, несущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента; имен­но к этой части антитела можно присоединить различные вещества; в частности для проведения иммуногистохимических реакций к данному фрагменту при­соединяют биотин, флуорохромы или ферменты.

Структурное разнообразие антител определяется последовательностью аминокислот в вариабельных областях тяжелых и легких цепей. Постоянные области иммуноглобулинов кодируются одним геном для каждого класса анти­тел. И антитела, и антигены могут быть поливалентными (т.е. иметь множество участков связывания) в результате повторения эпитопов и в результате наличия многих эпитопов, с которыми будут связываться разные антитела.

Антитела, которые используются в иммунологических методиках, полу­чают путем повторной иммунизации различных животных (чаще мышей, кро­ликов, крыс, овец, лошадей и др.) определенным антигеном. После выработки антител у иммунизированного животного берут сыворотку крови и очищают ее от других сывороточных протеинов.

Поскольку большие молекулы могут иметь несколько эпитопов, они стимулируют множество линий В-клеток, которые синтезируют несколько ви­

дов антител к разным эпитопам одного и того же антигена. Получаемые анти­тела называют «поликлональными», они являются смесью антител к различным эпитопам антигена.

Моноклональные антитела представляют собой продукт одного клеточно­го клона плазматических клеток, таким образом все антитела являются иммуно­логически идентичными и реагируют с одним эпитопом антигена, к которому они были получены. Получение моноклональных антител включает в себя сле­дующие этапы: иммунизация животных; подготовка В-лимфоцитов селезенки к слиянию; слияние с клетками миеломы; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител.

Важнейшим этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген - антитело». Антитела обладают свойством прочно связываться с тканевыми антигенами, при этом не связанные антитела можно удалить отмыванием срезов. Поскольку окрашенные продукты реакции являются нерастворимыми, они оседают в месте взаимодействия анти­тел. Для выявления образовавшегося в процессе реакции комплекса «антиген - антитело», используют различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител: ферменты, флуорохромы, биотин, металлы.

В настоящее время в качестве окрашенных меток широко используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Окисление пероксидазы хрена с по­мощью 3-диаминобензидина тетрахлорида придает продуктам реакции корич­невую окраску, в то время как щелочная фосфатаза после взаимодействия с различными субстратами (AS-MX фосфат, 5-бром-4-хлоро-3-индоксил фосфат и др.) формирует нерастворимые продукты, которые в зависимости от исполь­зуемого красителя можно окрасить в синий (прочный синий ВВ) или красный (прочный красный TR) цвет.

Подобным образом осуществляется визуализация первоначально не ви­димых тканевых и клеточных антигенов с помощью иммуногистохимической методики.