Новые лиганды Cys-петельных рецепторов и путь к лекарствам

Необходимость детекции и воздействия на отдельные подтипы нАХР определяет необходимость поиска и создания новых высокоаффинных и селективных лигандов. Основой служат многочисленные известные соединения, взаимодействующие с разными участками нАХР: агонисты, конкурентные антагонисты, блокаторы ионного канала, а также разнообразные модуляторы холинергической активности.

Как уже отмечалось, ранее наиболее востребованными инструментами изучения структурно-функциональных свойств нАХР служили а-нейротоксины из ядов змей, благодаря своему исключительно высокому сродству к некоторым подтипам рецептора. Однако не для всех нАХР имеются избирательно действующие на них нейротоксины змей. Так называемые «короткие» a-нейротоксины эффективно взаимодействуют только с мышечными нАХР; а-нейротоксины «длинного» типа узнают кроме мышечных также инейрональные гомоолигомерные (а7, а8, а9) холинорецепторы (см. обзор Tsetlin, 1999). Еще один токсический полипептид из яда B. multicinctus - к-бунгаротоксин - специфичен к гетероолигомерному а3р2 нАХР. а-конотоксины, пептиды из яда морских улиток семейства Conus, являются конкурентными антагонистами нАХР и имеют высокую избирательность действия на различные подтипы холинорецепторов (см. обзоры: Terlau, Olivera, 2004; Han et al., 2008; Tsetlin, Hucho, 2009).

Хотя природа дала нам большое количество соединений, различающих тот или иной тип Cys-петельных рецепторов, задачи поиска и конструирования новых представителей, которые с большей избирательностью помогали бы идентифицировать, а также активировать или дезактивировать интересующий подтип определенного (например нАХР) рецептора, остаются по-прежнему актуальными. В связи с важной ролью а7 нАХР много усилий было потрачено на то, чтобы модифицировать природные а-конотоксины и получить аналоги, пригодные для идентификации этих рецепторов в тканях. Это недавно удалось американским исследователям: на основе природного а-конотоксина ArIB были получены его аналоги с несколькими заменами, несущими радиоактивные и флуоресцентные метки, вполне пригодные для надежного детектирования а7 нАХР (Hone et al., 2010). Нам удалось на основе а-конотоксина PnIA получить аналог, имеющий очень высокое (0,5 nM) сродство к АХСБ L. stagnalis, а его радиоиодированное производное очень удобно для скрининга соединений с возможной холинергической активностью (Kasheverov et al., 2011).

Выход на новые природные соединения, которые могли бы сыграть роль инструментов в изучении рецепторов, сегодня имеется благодаря протеомным исследованиям ядов.

До сих пор мы рассматривали выделенные из ядов нейроактивные белки и пептиды, мишенью для которых служат различные нАХР. Чуть более 10 лет назад американскими исследователями в мозге мыши был обнаружен ген, кодирующий белок Lynxl, предположительно имеющий ту же трехпетельную структуру, что и а-нейротоксины змей (Miwa et al., 1999). Структура гена указывает, что эндогенный белок млекопитающих Lynx1 должен иметь и существенное отличие от нейротоксинов - дополнительный гликозил-фосфатидил-инозитольный (GPI) якорь. С помощью этого якоря Lynx1 прикреплен в мозге к мембране в непосредственной бли-

Рис 2. Кристаллическая структура димерного а-кобратоксина

Показаны исходные мономеры (А и А') а-кобратоксина. I-III - обозначения петель, имеющих Р-структурную конформацию. Две межмолекулярные дисульфидные связи образованы остатком Cys 3 и Cys 20 одного мономера с остатками Cys 20 и Cys 3 соседнего

Рис.

зости от никотиновых рецепторов и модулирует их функциональную активность. До недавнего времени Lynxi был недоступен в форме индивидуального белка. Поэтому все важнейшие исследования его функциональной активности, опубликованные в таких ведущих журналах, как Neuron и Science (см., например, Miwa et al., 2006; Morishita et al., 2010), были выполнены исключительно с использованием суперэкспрессии или нокаута гена Lynx 1. Информации о том, каков механизм взаимодействия Lynxi с нАХР, не имелось, а прогресс в этой области наметился, когда нам в 2011 г., благодаря экспрессии в E. coli и последующей очистке, удалось получить в виде индивидуального водорастворимого белка полноразмерный Lynx 1, не имеющий GPI якоря (ws-lynx1) (Lyukmanova et al., 2011). В результате впервые были установлены концентрации, при которыхможно в опытах in vitro зарегистрировать эффекты ws-lynx1 на различные подтипы нАХР. При этом было впервые показано различие в характере связывания ws-lynx1 с двумя основными типами нАХР: ws-lynx1 конкурировал с радиоактивным а-бунгаротоксином за связывание с рецептором мышечного типа, но не конкурировал за связывание с нейрональным а7 нАХР (рис. 3а). Однако электрофизиологические опыты выявили ингибирование токов в а7 нАХР при добавлении 10 mM ws-lynx1 (рис. 3б).

4.