Моделирование FUS-протеинопатий in vitro (клеточные культуры)

Основные данные по механизмам агрегации FUS были получены в результате исследований в культвируемых клетках, в том числе в дрожжах. Обычно для изучения агрегации и токсичности используют повышенную экспрессию того или иного гена - модели, основанные на его сверхэкспресии (Powers et al., 2009).

В самых ранних работах для изучения способности к агрегации и токсичности белка FUS дрожжевые клетки трансформировали плазмидой для экспрессии FUS человека, слитого с желтым флуоресцентным белком (YFP). Чтобы избежать преждевременной гибели клеток дрожжей во время роста из-за возможной токсичности экзогенного FUS, для экспрессии FUS-YFP использовали галактоза-индуциру- емый промотор. В отличие от клеток млекопитающих, в дрожжевых клетках нормальный белок FUS человека был большей частью сосредоточен в цитоплазме (Ju et al., 2011), что, возможно, связано с тем, что его NLS не узнается ядерными рецепторами дрожжей (Sun et al., 2011). В этих работах было показано, что повышенная концентрация FUS приводит к его агрегации в цитоплазме и токсична для дрожжевых клеток. При транслокации FUS в ядро, для достижения которой использовали FUS с NLS от SV40 (Goldfarb et al., 1986), уровень токсичности значительно снижался. Низкий уровень FUS, достигнутый с использованием слабого промотора, не был токсичен и не приводил к агрегации белка (Sun et al., 2011). Было также отмечено, что цитоплазматические агрегаты FUS-YFP в дрожжевых клетках были нестабильными, динамичными, напоминая Р-тельца и СГ. Под влиянием стресса FUS перераспределялся в Р-тельца и СГ. Более того, повышенная экспрессия FUS- YFP увеличивала частоту образования как Р-телец, так и СГ. Было показано, что для формирования агрегатов и токсичности FUS необходимы прионоподобный домен, РНК-связывающий мотив и домен RGG 2 (FUS1-422). При этом вариант, содержащий только прионоподобный домен и РНК-связывающий мотив (FUS1- 371), не агрегировал и белок находился в ядре.

И в дрожжевых клетках, и фибробластах домен RGG2 был необходим для агрегации в цитоплазме. Однако в клеточной культуре нейробластомы SH-SY5Y укороченный белок, FUS1-359, меченный GFP, агрегировал в цитоплазме (Shelkovnikova et al., 2013а). Белок FUS-YFP (50-526) также агрегировал в дрожжах и фибробластах, но образованные включения были меньше по размеру (Kino et al., 2011). FUS1- 422 был токсичен in vivo, однако для проявления токсичности требовалась более высокая его концентрация по сравнению с полноразмерным белком. В обоих случаях образовавшиеся агрегаты варьировали от 15 до 20 нм в диаметре и по структуре напоминали патологические включения в пораженной нервной ткани больных БАС (Baumer et al., 2010; Huang et al., 2010). Ассоциированные с БАС мутации в FUS не оказывали существенного влияния ни на формирование агрегатов, ни на их токсичность (Sun et al., 2011; Shelkovnikova et al., 2013а).

В ходе исследований in vitro с использованием очищенного рекомбинантного белка FUS было показано, что он обладает очень высокой агрегационной способностью. Выделение немеченного белка было трудно осуществимо из-за его быстрой агрегации, однако присутствие GST (глутатион^-трансферазы) на N-конце повышало растворимость FUS и позволило получить очищенный белок, который был способен к связыванию РНК. При этом при отщеплении GST с помощью протеазы TEV белок быстро агрегировал без какой-либо дополнительной стимуляции, например перемешивания. Агрегация также зависела от концентрации белка. Полученные агрегаты не окрашивались амилоидными красителями и растворялись в присутствии SDS, в отличие от агрегатов дрожжевого белка Sup35, несущего прионоподобный домен. Таким образом, был сделан вывод, что агрегаты FUS имеют неамилоидную природу (Sun et al., 2011).

Еще в одной серии экспериментов (Sun et al., 2011) попытались установить гены, способные модулировать токсичность FUS. В ходе скрининга в дрожжах было выявлено 10 генов, продукты которых повышали токсичность FUS, и 24 гена, продукты которых ее ослабляли, при этом все они были вовлечены в метаболизм РНК. Некоторые из этих генов имеют гомологи у человека, которые, возможно, могут также влиять на токсичность FUS у человека. Это подтвердилось на примере генов, кодирующих убиквитин-лигазу FBXW7 и фактор инициации трансляции EIF4A1 (гомологи дрожжей Cdc4 и Tif2, соответственно), которые супрессировали токсичность FUS и его мутантов R521C и R521H в культуре клеток млекопитающих HEK293T (Sun et al., 2011). Сходные результаты были получены на культуре клеток COS7 (Sun et al., 2011). Кроме того, в список супрессоров вошли гены, продукты которых вовлечены в формирование СГ у дрожжей, - это факторы инициации трансляции Tif2, Tif3 и Pab и дрожжевой аналог белка PABP-1 (polyA-binding protein 1) человека (Sun et al., 2011).

Несмотря на обширную информацию, полученную при анализе in vitro моделей, ряд вопросов по-прежнему оставался открытым, например, временные харак- тиристики агрегации FUS, токсичность для разных типов клеток, в том числе и разных типов нейронов и т.д. Для ответа на эти вопросы необходимы были создание и характеристика in vivo моделей.

6.