Анализ кинетики накопления 5-АЛК-индуцированного Пп IX в аутоидентичных клеточных культурах

Во время проведения операций по удалению глиальных опухолей (НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко) были замечены различия в накоплении протопорфири- на IX в опухолях одной степени озлокачествления - мультиформной глиобластомы.

В связи с этим было решено более подробно изучить механизм накопления Пп IX в клетках. С этой целью был проведен ряд исследований на клеточных культурах соответствующих опухолей. Их целью являлась регистрация изменения концентрации Пп IX в клетках опухолей, показавших различия в накоплении маркера во время операции, с течением времени.

Содержание эндогенных флуорофоров (порфирины, ФАД, НАД-Н, коллаген, эластин, триптофан) в тканях, а также количественные данные об их концентрации и изменении с течением времени дают важную информацию о состоянии клеток тканей. ФАД и НАД-Н участвуют в обменных процессах клеток, поэтому изменение их флуоресценции непосредственно связано с изменениями в окислительно-восстановительных реакциях клеток. Максимум флуоресценции ФАД лежит в диапазоне 520-540 нм, а НАД-Н - 440-470 нм. Также эндогенные флуорофоры применяются для медицинской диагностики, ярким примером является протопор- фирин IX (Пп IX), который участвует в процессе биосинтеза гема.

Для получения спектральных данных по динамике (с течением времени) накопления Пп IX в клетках соответствующих опухолей использовался комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа CarlZeiss серии LSM 710. Для возбуждения флуоресценции был выбран лазер с к=514 нм, для подавления лазерного излучения использовались специальные фильтры. Спектры измеряли в диапазоне 520-750 нм, с шагом 9,7 нм, с интервалом времени 10 минут, для последних проходов интервал времени составил 30-40 минут.

При обработке данных основной целью является определение количества компонент и их концентраций. Для этого был использован метод главных компонент (ГК). Так как целью настоящего исследования было определение реального содержания веществ в клетках опухоли, помимо анализа МГК была проведена линейная декомпозиция спектров с использованием априорной информации, с предположением, что экспериментальные спектры состоят лишь из спектров флуоресценции ФАД, уропорфирина и Пп IX. В соответствии с этим каждая ГК является линейной комбинацией спектров реальных компонент, поэтому ГК были разложены на составляющие с получением матрицы С(2*2), где строки соответствуют реальным компонентам, а столбцы - ГК.

Исследуемые объекты:

1. Для определения концентрации веществ в мг/мл были проведены измерения на Zeiss LSM 710 пяти стандартных образцов с различной концентрацией Пп IX (10^-2—10^-6 мг/мл).

2. В исследовании приняли участие двое пациентов с глиобластомами, у которых в процессе удаления были выявлены различия в уровне флуоресценции опухолевых тканей. Операции проводились в рамках клинических исследований эффективности интраоперационной диагностики с использованием 5-АЛК на базе НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. 5-АЛК вводилась пациентам за два часа до начала операции. Операция проводилась с использованием видеофлуоресцентного режима Blue 400 (ZeissOpmiPentero) под спектроскопическим контролем (ЛЭСА- 01-БИОСПЕК).

3. Клетки опухолей пациентов были культивированы в Институте биологии гена РАН. Полученные клеточные культуры были разморожены и помещены в питательную среду RPMI для дальнейшего роста. Для увеличения количества Пп IX в клетках была добавлена 5-АЛК с концентрацией 100 мг/мл и pH 7,4, что соответствует благоприятным условиям для жизнедеятельности клеток.

В результате анализа спектральных данных для культуры первого типа была получена кинетическая кривая, приведенная на рис. 1. Значительное изменение концентрации Пп IX наблюдается спустя примерно 60 минут с момента добавления 5-АЛК в образец.

Рис. 1. Изменение концентрации Пп IX в клеточной культуре первого типа после инкубации с 5-АЛК

Рис. 2. Изменение концентрации Пп IX в клеточной культуре второго типа после инкубации с 5-АЛК

Слева приведены данные, полученные во временном диапазоне от 10 до 250 минут, справа - начальный этап накопления (от 10 до 80 минут), демонстрирующий сходство кинетической кривой на этом этапе с кинетической кривой для первой культуры, полученной во временном диапазоне от 10 до 250 минут

По спектральным данным второго типа можно наблюдать, что рост концентрации Пп IX происходит значительно быстрей, чем в первом образце, и значительное изменение концентрации Пп IX заметно спустя уже 30 минут с момента добавления 5-АЛК в образец (рис.

Рассматривая общий характер кривых изменения концентрации Пп IX для обоих типов клеточных культур, можно построить следующую зависимость (рис. 3). Изменение концентрации Пп IX для первого образца происходит в области левее точки А, тогда как для второго - охватывает и первую, и вторую области.

Рис. 3. Сигмоидная кривая, демонстрирующая характер накопления Пп IX в клеточных культурах

Для первого и второго типа клеточных культур можно определить характерные времена, когда концентрация достигает определенных уровней, и оказывается, что отношение характерных времен для первого и второго типов примерно одинаково, в соответствии с чем была предложена математическая модель накопления в клетках Пп IX, учитывающая концентрацию основных ферментов, участвующих в биосинтезе гема.

С использованием этой модели была проведена экстраполяция кинетических кривых за границы диапазона измерений. Было показано, что максимум концентрации Пп IX в клеточной культуре первого типа был бы достигнут примерно спустя 12 часов после добавления 5-АЛК в образец. Следовательно, низкий уровень накопления Пп IX, наблюдавшийся интраоперационно, можно объяснить тем, что между вводом пациенту 5-АЛК и операцией прошло недостаточное количество времени для достижения максимума концентрации Пп IX.

4.2.